動物鼻式氣溶膠暴露裝置的運行效果評價

郝新彥，向志光，高 虹

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

動物鼻式氣溶膠暴露裝置(nose-only inhalation exposure device)是可模擬產生藥物、毒物等化學物質及病毒、細菌等病原微生物氣溶膠、氣體或蒸汽的設備，僅將動物鼻部暴露于設定環境中，使動物吸入含有受試物的空氣而達到定量攻毒感染[1- 3]。鼻式氣溶膠暴露裝置可通過裝有細菌、病毒等病原微生物懸浮液的霧化器霧化產生微生物氣溶膠，實驗動物吸入氣溶膠后，在感染過程中避免了消化道、皮膚等其他暴露途徑感染，感染方式與自然環境極為相似[1-9]。為使用動物鼻式氣溶膠暴露裝置進行安全有效的病原微生物氣溶膠感染，本實驗選擇大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus)MHV-JHM作為模式微生物，分別代表細菌和病毒，使用此暴露裝置發生細菌、病毒氣溶膠，探究裝置能否正常運行，同時探討裝置運行過程中產生的氣溶膠粒徑大小、裝置氣密性、氣溶膠在暴露艙內的分布均勻性及消毒劑對裝置的消毒效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

菌種、病毒：大腸桿菌(有氨芐抗性，Amp+)、鼠肝炎病毒毒株MHV-JHM毒株均引自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所。

1.2 主要試劑與儀器

LB固體培養基(Amp+)，LB液體培養基(Amp+)，DMEM無血清高糖培養基，RNA提取試劑盒(TaKaRa，9766，北京寶日醫生物技術有限公司)，一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa，RR064A，北京寶日醫生物技術有限公司)，硝酸纖維素(NC)膜(Millipore，0.45 μm)。ABI 7500 Real-time PCR擴增儀(USA)，動物鼻式氣溶膠暴露裝置(美國In-TOX P.O.BOX2070，NM505-832-5107)：動物鼻式氣溶膠暴露裝置主要由潔凈壓縮空氣系統、氣溶膠輸送管路、凈化裝置(真空泵、高效過濾器)、氣溶膠發生裝置(Lovelace噴霧器、稀釋器、混合器)、48孔鼻式暴露艙、測試動物安置裝置(動物固定管)、采樣裝置(ZR-A02型安德森六級采樣器、In-TOX液體撞擊采樣器)和暴露系統控制柜組成(如圖1所示)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物鼻式氣溶膠暴露裝置產生大腸桿菌氣溶膠

(1)氣溶膠粒徑大小評價：將6.5 mL 2 × 109CFU/mL大腸桿菌菌液倒入噴霧器小管內，稀釋流量為18.3 L/min，排氣流量為20 L/min，維持暴露艙微負壓。設置裝置在霧化壓力為5, 10, 15, 20, 25 PSI下發生氣溶膠，安德森六級采樣器在總排氣管路分別采樣20 min。采樣平皿于37℃下培養12 h，評價在不同壓力下采樣氣溶膠的粒譜分布。將各級采樣平皿采集的氣溶膠顆粒按級別分為6組數據，依據偏態分布50%中值直徑計算公式算出發生氣溶膠總粒子的中值直徑。

(2)氣溶膠到達暴露艙端口評價：將6.5 mL 2 × 109CFU/mL大腸桿菌菌液倒入噴霧器小管內，稀釋流量為18.3 L/min，排氣流量為20 L/min，霧化壓力為20 PSI，采樣流量為2.2 L/min，維持暴露艙微負壓，以LB液體培養基作為采樣液，液體撞擊采樣器采樣20 min。分別取采樣液1 mL涂于兩個LB固體培養基上，于37℃下培養12 h，觀察采樣平皿上是否有菌落生長，評價暴露艙端口是否有氣溶膠通過。

(3)氣溶膠分布均勻性評價：48孔動物鼻式暴露艙共4層，每層間隔3個端口放置一個固定管(如圖2所示)，NC膜(1 cm × 1 cm)置于小鼠固定器前端端口處采樣20 min。將NC膜放于LB固體培養基上，于37℃下培養12 h，觀察NC膜上是否有菌落生長并計數，評價暴露艙各端口是否都有氣溶膠到達，氣溶膠分布是否均勻。其他參數設置同1.3.1中的(2)。

圖1 In-TOX鼻式氣溶膠暴露系統示意圖Figure 1 Schematic figure of the In-TOX nose-only inhalation exposure device

注：圖中(1)～(4)分別為暴露艙的從上至下1～4層，在各層①、②、③暴露口放置小鼠固定器，并用NC膜進行采樣。圖2 48孔鼻式暴露艙各層各端口分布圖Note. Figures (1)-(4) are representative of layers 1-4 of the exposure chamber from top to bottom. Animal tubes were placed on port ①, port ②, and port ③ of each layer. The NC membrane placed at the nozzle of animal tubes was used for sampling.Figure 2 Each port of each layer in the 48-port nose-only exposure chamber

(4)裝置氣密性評價：在進行1.3.1中的(1)、(2)、(3)發生E.coli氣溶膠操作時，在暴露裝置易發生泄露的6處(霧化器旁、暴露艙上端排氣處、安德森六級采樣器旁、液體撞擊采樣器旁、高效過濾器旁、真空泵旁)擺放沉降平皿，沉降20 min。將沉降平皿于37℃下培養12 h，觀察沉降平皿上是否有菌落生長，評價暴露裝置是否發生氣溶膠泄露。

(5)裝置消毒效果評價：大腸桿菌氣溶膠停止運行后，空運行系統10 min，以排出含有大腸桿菌氣溶膠的氣體；將8 mL 75%乙醇加入噴霧器小管內，系統運行30 min進行消毒；消毒后空運行系統30 min，以排出含有乙醇的空氣。消毒結束后，空運行系統并使用安德森六級采樣器采樣20 min。采樣平皿于37℃下培養12 h，觀察平皿上是否有菌落生長，評價在裝置產生大腸桿菌氣溶膠后，75%乙醇對裝置的消毒效果。其他參數設置同1.3.1中的(2)。

1.3.2 動物鼻式氣溶膠暴露系統產生MHV-JHM氣溶膠

(1)發生MHV-JHM氣溶膠：取6.5 mL備好的1.5 × 108拷貝數/mL的MHV-JHM病毒液倒入噴霧器小管內，霧化流量為0.6 L/min，稀釋流量為18.3 L/min，排氣流量為20 L/min，霧化壓力為20 PSI，采樣流量為2.2 L/min，維持暴露艙微負壓，以DMEM無血清高糖培養基為采樣液，液體撞擊采樣器在暴露艙單個端口采樣20 min。收集采樣液進行后續RNA提取[1.3.2中的(3)]及一步法RT-PCR檢測病毒RNA擴增的熒光值[1.3.2中的(4)]。評價系統是否發生病毒氣溶膠，及單個暴露艙端口是否有氣溶膠氣流通過。

(2)裝置氣密性評價：待系統停止氣溶膠發生后，滅菌棉簽采集易泄露的5處(開放空氣過濾器處、霧化器小管處、液體撞擊采樣器處、暴露艙端口處、暴露艙上端進氣管路處)MHV-JHM氣溶膠。將采樣棉簽放于DMEM無血清高糖培養基中，對培養基進行后續RNA提取[1.3.2中的(3)]及一步法RT-PCR檢測病毒RNA擴增的熒光值[1.3.2中的(4)]。評價裝置在運行過程中是否發生氣溶膠泄露。

(3)提取RNA：以DMEM無血清高糖培養基作為陰性對照，使用RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取氣溶膠發生液、采樣器采樣液及1.3.2第(2)條中所采集樣本的RNA，并于-30℃保存備用。

(4)一步法RT-PCR擴增：病毒MHV-JHM一步法RT-PCR的引物、探針由賽默飛世爾科技(中國)有限公司設計并合成，其序列見表1。其中，熒光探針5’端標記為FAM，3’端標記為BQ1。

以1.3.2第(3)條中提取的RNA為模板，以ddH2O設置陰性對照，使用一步法RT-PCR試劑盒，應用ABI 7500 Real-time PCR系統進行熒光定量PCR擴增。反應體系如表2所示，共20.0 μL。RT-PCR反應程序為：反轉錄反應(42℃，5 min；95℃，10 s)，1個循環；PCR反應(95℃，5 s；60℃，34 s)，共40個循環。進行病毒RNA檢測。

(5)裝置消毒效果評價：病毒氣溶膠停止運行后，空運行系統10 min，以排出含有病毒氣溶膠的氣體；將6.5 mL 3%過氧化氫溶液加入噴霧器小管內，系統運行30 min進行消毒；消毒后空運行系統30 min，以排出含有過氧化氫的空氣。消毒結束后，空運行系統，以DMEM無血清高糖培養基為采樣液，液體撞擊采樣器在暴露艙單個端口采樣20 min。收集采樣液進行后續RNA提取[1.3.2中的(3)]及一步法RT-PCR檢測病毒RNA擴增的熒光值[1.3.2中的(4)]，評價在裝置產生MHV-JHM病毒氣溶膠后，3%過氧化氫溶液對裝置的消毒效果。其他參數設置同1.3.2中的(1)。

2 結果

2.1 氣溶膠粒徑大小評價結果

由表3和圖3可知，在霧化壓力為5～25 PSI條件下，安德森六級采樣器所采集的氣溶膠顆粒主要集中分布在5級(1.1～2.1 μm)、6級(0.65～1.1 μm)，中值直徑在(1.27±0.61) μm。提示鼻式氣溶膠暴露裝置能正常運行，產生中值直徑為(1.27±0.61) μm氣溶膠顆粒。

2.2 氣溶膠到達暴露艙端口評價結果

液體撞擊采樣器采樣E.coli氣溶膠，取采樣液1 mL分別涂兩平板，培養后兩平板上均有菌落生長，菌落數分別為64、84。ABI 7500 Real-time PCR系統檢測到液體撞擊器采樣樣本中的MHV-JHM RNA為陽性(如圖4所示)。提示裝置能正常運行發生細菌、病毒氣溶膠，且產生的氣溶膠可以到達暴露艙端口。

2.3 氣溶膠分布均勻性評價結果

NC膜上有菌落生長，菌落數均在10左右，計數結果如表4所示，暴露艙各端口菌落數一致。提示產生的氣溶膠均到達暴露艙各端口，且氣溶膠分布均勻。

表1MHV-JHM病毒RT-PCR擴增引物及熒光探針

Table1Primers and fluorescent probes for RT-PCR of MHV-JHM

探針/引物名稱Probe/Primer names序列(5’ → 3’)Sequences (5’ → 3’)MHV-JHM FGGAACTTCTCGTTGGGCATTATACTMHV-JHM RACCACAAGATTATCATTTTCACAACATA探針 ProbeACATGCTACGGCTCGTGTAACCGAACTGT

表2 一步法RT-PCR反應體系Table 2 Reaction system of one-step RT-PCR

表3 安德森六級采樣器捕獲粒徑分布情況及中值直徑結果Table 3 Particle size distribution and mass median aerodynamic diameter of aerosol sampled by Andersen six-stage sampler

注：中值直徑：P50=L + i/f(50%n - c)，其中，L為中位數所在組段的下限；i為該組段的組距；f為中位數所在組段的頻數；n為總的累積頻數；c為小于L各組段的累積頻數。

Note. Mass median aerodynamic diameter (MMAD):P50=L + i/f(50%n - c). In the formula, L: lower limit of group segment with median; i: the group range of the group segment with median; f: frequency of the group segment with median; n: total cumulative frequency; c: cumulative frequency of each group less than L.

注：標號1～5：分別是In-TOX動物鼻式氣溶膠暴露系統在霧化壓力為5，10，15，20，25 PSI條件下所產生的E. coli氣溶膠結果圖。第一行(標號1)：1-1至1-6分別是霧化壓力為5 PSI條件下，安德森六級采樣器從1級到6級采樣平皿的菌落數；第二行至第五行(標號2～5)：每行內各標號與第一行同理，分別是霧化壓力為10，15，20，25 PSI條件下，安德森六級采樣器從1級到6級采樣平皿的菌落數。圖3 安德森六級采樣器采樣氣溶膠分布結果Note. Labels 1-5: The distribution of E. coli aerosol sampled by the In-TOX animal nose-only inhalation exposure system under the conditions of 5, 10, 15, 20, and 25 PSI nebulizer pressure. In the first row (label 1), 1-1 to 1-6 represent the numbers of colonies from stage 1 to stage 6 of the Anderson six-class sampler under the condition of 5 PSI nebulizer pressure. For the second to the fifth rows (labels 2-5), equivalent values are presented for nebulizer pressures of 10, 15, 20, and 25 PSI, respectively.Figure 3 The distribution result of aerosol sampled by the Andersen six-stage sampler

注：1：MHV-JHM病毒發生液；2：液體撞擊器采集MHV-JHM病毒氣溶膠。圖4 實時熒光定量PCR實驗Note. 1: MHV-JHM virus liquid; 2: MHV-JHM aerosol sampled by liquid impinger.Figure 4 Test of real-time fluorescence quantitative PCR

暴露艙層數The layer of the exposure chamber暴露艙各層端口 The port of each layer①②③均值Mean1109109.7211101010.3310101110.3410999.3

2.4 裝置氣密性評價結果

放置在暴露裝置易發生泄露部位的6個沉降平板上大腸桿菌菌落計數為0；一步法RT-PCR檢測易泄露處(開放空氣過濾器處、霧化器小管處、液體撞擊采樣器處、暴露艙端口處、暴露艙上端進氣管路處)采樣樣本中的病毒RNA為陰性。提示鼻式氣溶膠暴露裝置在發生氣溶膠過程中未發生氣溶膠泄露，氣密性良好。

2.5 裝置消毒效果評價結果

對系統進行消毒后，放置在安德森六級采樣器上的6個采樣平皿上大腸桿菌菌落計數為0；一步法RT-PCR檢測裝置進行消毒后的采樣樣本中的病毒RNA為陰性。表明E.coli氣溶膠、MHV-JHM氣溶膠分別在75%乙醇、3%過氧化氫運行后可被徹底殺滅，提示使用相應的消毒劑可對系統進行有效的消毒，消毒效果完全。

3 討論

本實驗選擇大腸桿菌和鼠肝炎病毒分別代表細菌和病毒發生氣溶膠，使用安德森六級采樣器、液體撞擊采樣器、NC膜進行采樣。安德森六級采樣器采集粒譜范圍廣、采樣效率高、微生物失活率低、敏感性高[10-11]，故采樣平皿培養后的菌落計數結果明顯；液體撞擊采樣器采樣時間通常為1～10 min時采樣效率較高[12-13]，之前研究表明，采樣流量多設置為10 L/min左右[11]；但在此鼻式氣溶膠暴露裝置中，液體撞擊采樣器所在采樣管路本身采樣流量小，最大為2.2 L/min，為增加采樣量，實驗中采樣時間長，為20 min，存在微生物粒子撞擊時的損傷、微生物粒子逃逸和再次氣溶膠化、收集介質蒸發等問題，采樣效率低，故采集到的細菌氣溶膠經培養后活菌菌落數較少[11, 14]。對液體撞擊采樣器采集到的病毒氣溶膠，使用靈敏度高、高效快速的實時熒光定量RT-PCR法進行檢測。本次實驗因NC膜易于裁剪、使用方便，故使用NC膜進行采樣；LB液體培養基浸潤的NC膜(1 cm × 1 cm)放在動物固定管噴嘴處，面積較小，且不宜長時間采樣、采樣效率低[11]，故菌落計數較少。

對于安德森六級采樣器1級(> 7.0 μm)、2級(4.7～7.0 μm)相當于人體的鼻、咽、喉等上呼吸道；3～6級相當于人體的下呼吸道：3級(3.3～4.7 μm)相當于人體的氣管、支氣管，4級(2.1～3.3 μm)相當于人體的二級支氣管，5級(1.1～2.1 μm)相當于人體的終末細支氣管，6級(0.65～1.1 μm)相當于人體的肺泡[15]。研究表明，氣溶膠粒子在人體呼吸器官的沉積分節與其粒子大小有關，5～10 μm的易沉著于氣管和支氣管，而1～5 μm的粒子可直接侵入肺泡[16-20]。現已評價In-TOX鼻式氣溶膠暴露裝置能正常運行，產生中值直徑為(1.27±0.61) μm的氣溶膠顆粒，顆粒大小可直接侵入肺泡，所發生的氣溶膠滿足氣溶膠吸入感染實驗的要求；產生的氣溶膠可以到達且均勻分布到暴露艙各個端口，運行過程中未發生氣溶膠泄露，暴露裝置氣密性良好，使用相應的消毒劑可對系統進行有效的消毒，消毒效果完全。在實驗過程中，用以發生氣溶膠的懸浮液用量較少；鼻式暴露艙能同時感染多只動物，安全性、準確性提高，動物鼻式氣溶膠暴露裝置在微生物氣溶膠感染中受到越來越多的關注。本研究為動物鼻式氣溶膠暴露裝置安全有效地用于實驗動物高致病性病原微生物氣溶膠的吸入感染研究提供依據。