生物安全型禽負壓隔離器的研制

張宗興，祁建城*，吳金輝，張恩雷，張金明，衣 穎

(1.軍事科學院衛勤保障技術研究所，天津 300161； 2.國家生物防護裝備工程技術研究中心，天津 300161)

近年來，在全球范圍內高致病性禽流感疫情頻發，而我國部分地區成為疫情重災區，已造成嚴重的經濟損失。同時，全球各地不斷出現人感染禽流感疫情，截止到2013年底，僅我國(包括香港與臺灣地區)就有48人死于高致病性禽流感[1]，且仍處于進一步擴散態勢，已對我國的公共衛生安全構成嚴重威脅。高致病性禽流感已被世界動物衛生組織列為法定必須上報的A類傳染病，在我國也被列為《國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020年)》優先防治一類動物疫病[2]。因此，世界各國開始加大投入開展與禽流感相關的科學實驗研究。由于高致病性禽流感的危險性，為降低感染風險，開展高致病性禽流感感染動物的飼養、實驗以及檢驗檢疫等操作需要在高等級生物安全動物隔離器內進行。

目前，國內從事禽流感科學研究的實驗室大多數使用的是國產隔離器，多由飼養SPF級動物的籠具改造而成[3]，在關鍵的生物安全指標方面，難以達到CNAS-CL53《實驗室生物安全認可準則對關鍵防護設備評價的應用說明》[4]的技術要求，無法滿足高致病性感染動物實驗的生物安全要求，存在較大的生物安全隱患。因此，使用此類國產隔離器的實驗室，均存在無法通過CNAS評審而不能繼續開展相關實驗研究的問題。而國外進口設備價格昂貴，且存在后期維護依賴外方、有保密安全隱患等嚴峻問題，難以滿足我國廣泛開展相關研究的現實需求，嚴重制約了我國高致病性病原微生物防控的能力和水平，亟需研發技術性能指標滿足標準要求的隔離操作設備。

1 禽負壓隔離器簡介

禽負壓隔離器是動物隔離器的一種。動物隔離器作為一種實驗動物專用設施，可通過采用多種有效隔離方法維持隔離器內部環境(實驗動物所處環境)與外界環境處于有效隔離狀態(無菌或無外來污染)，如空氣經過高效過濾器后送入，并經過高效過濾器處理后排出，物品經過無菌處理后方能進出飼養空間，該設備既能保證動物與外界隔離，又能滿足動物所需要的特定環境；同時，避免操作者穿著過多的防護服，改善操作人員工作的舒適度、靈活性，降低誤操作，提高安全水平；感染物質完全受控，使污染區域最小化[5]。

根據壓力可將隔離器分為正壓隔離器和負壓隔離器。正壓隔離器是指隔離器內壓力高于外部大氣壓力，多用于清潔動物飼養(防止外部環境感染內部環境)；負壓隔離器則指隔離器內壓力低于外部大氣壓力，多用于感染動物實驗(防止內部環境有害物質污染外部環境)，通常高等級生物安全實驗室安裝負壓動物隔離器進行感染動物的飼養和實驗。根據負壓隔離器的機械密封性能，又可將隔離器分成非氣密式隔離器和氣密式隔離器。兩者主要區別在于設備結構、消毒方式、氣密性要求等方面。非氣密式隔離器多用于飼養中型動物，由于非氣密式隔離器無法有效防止病原微生物泄漏至其所在室內環境，若開展攜有或感染了高致病病原微生物的動物實驗時，必須有效提高實驗室基礎隔離設施的防護水平和人員個體防護水平，這極大地提高了開展此類實驗活動的門檻；而氣密式動物隔離器則可以保證在開展同類實驗活動時起到有效安全隔離的作用，有效降低了對實驗室基礎隔離設施和人員個體防護的要求，更加適用于我國目前的大多數ABSL-3實驗室。

我國實驗室生物安全裝備起步較晚，且由于國產禽負壓隔離器多數是通過對用于SPF級動物飼養的正壓隔離器改造而來，其箱體結構氣密性、高效過濾器安裝可靠性、過濾器原位檢測、物品氣密傳遞、氣(汽)體消毒、手套的連接方式、操作方便性等方面與進口產品均存在較大差距。目前，國內引進的進口禽負壓隔離器主要來自美國與法國的兩家公司，兩者的結構形式存在較大差異，箱體主體結構分別采用了不銹鋼材質與HDPE(高密度聚乙烯)材質，傳遞裝置則分別采用了液體密封傳遞與快速傳遞接口(rapid transfer ports，RTP)雙門傳遞系統。引進上述進口隔離器除存在前文提到的問題之外，在隔離器本身技術層面，仍存在一些問題，比如：①壓差控制多采用手動調節方式，無法實時對壓差進行自動調節；②手套口中心風速普遍偏低，無法在操作手套脫落情況下自動增大隔離器排風量以提高手套口風速；③某些型號隔離器無法安全更換手套，即手套更換過程中無法保證隔離器整體氣密性；④某些型號隔離器本身缺少高效過濾器原位檢漏的條件；⑤密閉閥均為手動操作，操作不便。

2 生物安全型禽負壓隔離器設計原則

生物安全型禽負壓隔離器不僅需要具備高可靠性的高效空氣過濾裝置以有效防止隔離器內部有毒有害微粒未經過濾而泄漏到外部，而且需要具備良好的箱體嚴密性和穩定的負壓控制以實現機械密封和負壓雙重隔離防護，其所有操作均需要通過手套來實現且物品傳遞過程中不能破壞隔離器箱體的嚴密性，同時，還需具備對隔離器進行整體消毒的技術措施以滿足生物安全要求。因此，生物安全型禽負壓隔離器(以下簡稱“隔離器”)的設計主要遵循三個原則：一是可滿足我國相關標準的要求；二是建立方便快捷的氣密傳遞鏈條；三是建立完整的消毒鏈條。

我國關于動物飼養環境的標準主要有GB 14925-2010《實驗動物 環境及設施》[6]，關于生物安全性能評價標準主要為RB/T 199-2015《實驗室設備生物安全性能評價技術規范》[7]與GB 50346-2011《生物安全實驗室建筑技術規范》[8]；同時，本文所研究的隔離器為氣密式隔離器，其結構與Ⅲ級生物安全柜類似，因此可參考采用JG 170-2005《生物安全柜》[9]。在本產品設計過程中，充分參考了上述標準的相關要求。

隔離器的物品傳遞系統主要用于實驗前與實驗過程中清潔物品的傳入，實驗過程中血液唾液等樣本、實驗廢棄物、糞便等物品的傳出。實驗前，需要將實驗雞、飼料、實驗裝置等提前放入隔離器；實驗過程中，需要向隔離器內定期添加飼料與放入實驗器材，同時需要不定期從隔離器內取出采集的樣本、已使用的器材(不可重復使用的)、死亡的雞等，并定期取出收集的糞便。其中，動物糞便的處理有干法和濕法兩種處理手段：干法通常是在隔離器的底部鋪設塑料布，定期或實驗結束后將落滿糞便的塑料布卷起，打包傳出；濕法通常是定期使用沖洗水槍沖洗隔離器底部的糞便，并將污水排放至污水收集裝置。

隔離器的消毒鏈條主要包括隔離器(含高效過濾器)本身以及所有在實驗過程中從隔離器內傳出物品的消毒，包括污染廢棄物、采集樣本、動物糞便、污水(濕法)等。隔離器在整個實驗周期結束后，需要進行整體氣體消毒；實驗過程中污染廢棄物的傳出，需要進行無害化處理，如高溫或氣體消毒；對于采集的樣本，由于需要進行進一步的實驗或樣本保留，只能對其所收集的容器表面進行氣體消毒；采用干法收集的動物糞便，可采用高溫消毒或液體浸泡消毒方式，而采用濕法收集的動物糞便則主要采用液體消毒方法。

3 隔離器結構設計

禽負壓隔離器主要由隔離箱體、通風過濾系統、傳遞系統、自控系統、污水收集處理系統組成，如圖1所示。

注：1：顯示屏；2：電源開關；3：設備門；4：RTP傳遞系統；5：手套口；6：可折疊式置物臺；7：送風口；8：排風口；9：飲用水接口；10：液體沖洗接口；11：底部水槽；12：支架；13：腳輪；14：排水截止閥；15：過濾器；16：排水管；17：污水收集桶截止閥；18：污水收集桶；19：污水收集桶蓋；20：消毒接口。圖1 隔離器正視圖Note. 1: Display screen; 2: power switch; 3: equipment door; 4: RTP transfer system; 5: glove port; 6: folding shelving unit; 7: air supply outlet; 8: air exhaust outlet; 9: drinking water port; 10: liquid wash port; 11: bottom water channel; 12: trestle; 13: trundles; 14: drainage globe valve; 15: filter; 16: drain-pipe; 17: globe valve of sewage collection bucket; 18: sewage collection bucket; 19: bung of sewage collection bucket; 20: sterilization port.Figure 1 Front view of isolator

3.1 箱體

隔離器箱體四周均采用硬質透明材料密閉焊接制作，具有良好的可視性，同時箱體上的所有接口均采用密閉方式穿板連接以有效保證隔離器的密封性。隔離器的頂部為通風過濾系統和自控系統。隔離器箱體頂部面板設置禽飲用水接口和沖洗用水接口，工作臺面由多塊格柵板組成，用于禽類棲息以及放置飼料和飲水，金屬網架的底部為排水槽，用于收集糞便和污水。隔離器箱體底部安裝不銹鋼支架，支架底部四角均設置移動腳輪。

隔離器兩側操作面板上均安裝有長手套，長手套通過彈性橡膠圈固定于箱體法蘭凹槽上。用于固定手套的法蘭上設置有兩條凹槽，可方便在線安全更換手套[10]。長手套為氯丁橡膠(neoprene)材質，具有良好的操作手感，同時對臭氧、紫外線、濃酸、濃堿和強氧化劑都有很好的耐性，適用于生物安全操作環境。隔離器箱體兩端分別設置設備門和RTP傳遞系統。隔離器箱體內頂部設置可折疊式置物臺，需要時可將臺架放下用于臨時擺放實驗器材。

3.2 通風過濾系統

通風過濾系統由送風高效過濾器、排風高效過濾器、通風管路、生物密閉閥、排風機等組成，如圖2所示。進風口設置有初效過濾器，送、排風高效過濾器均為H14級高效過濾器，其最低穿透粒徑(most penetration particle size，MPPS)過濾效率≥ 99.995%。

禽負壓隔離器的送排風高效過濾器均應具備原位檢漏條件以檢測過濾器的完整性和安裝的可靠性，從而有效防止病原微生物擴散至外環境。由于送風高效過濾器的出風面緊鄰隔離器進風口，因此采用在隔離器內通過手動掃描檢漏方式對其進行原位檢漏。排風高效過濾器則采用效率法進行原位檢漏，在排風高效過濾器的下游管路的氣溶膠混勻處設置有下游氣溶膠采樣口。為了防止禽類啄擊與羽毛堵塞高效過濾器，在送風高效過濾器出風面和排風高效過濾器進風面均設置有金屬濾網和初效過濾器。在排風高效過濾裝置的下游設置有生物密閉閥，密閉閥的下游安裝有變頻離心風機。

注：箭頭表示氣流方向。圖2 隔離器通風過濾系統原理圖Note. Arrows indicate the direction of airflow.Figure 2 Diagram showing principle of isolator ventilation filtration system

3.3 傳遞系統

傳遞系統位于隔離器箱體兩端，由設備門和RTP傳遞系統組成。設備門可用于在實驗準備階段，可通過設備門將實驗用禽類、飼料、實驗裝置等提前放入隔離器，同時，為了避免在實驗過程中人員誤操作而打開設備門，在設備門上設置了鎖具。RTP傳遞系統主要用于實驗過程中物品的傳入和傳出，主要包括飼料、實驗器材、采集的樣本、已使用的器材(不可重復使用的)、死雞、糞便等。RTP傳遞系統由安裝在隔離器上RTP傳遞門和RTP傳遞桶組成，RTP傳遞門通常稱為α門，而RTP傳遞桶上的門稱為β門。將傳遞桶安裝到α門之后，傳遞桶與隔離器形成密封，同時，α門與β門結合在一起并形成密封，打開α門與β門的合體門之后，隔離器與傳遞桶相連通。根據傳遞桶的材質，可分為不銹鋼材質和HDPE(高密度聚乙烯)材質，不銹鋼傳遞桶采用高溫高壓方式對其內部物品及內腔進行消毒，傳遞桶上安裝有用于泄壓的高效過濾器；而HDPE傳遞桶則采用氣(汽)體熏蒸消毒，其桶底外部安裝有2個消毒接口用于連接消毒機，桶底內部安裝有2只高效過濾器，分別與消毒接口連通。HDPE傳遞桶可用于傳遞需要保存的樣本，采用氣體熏蒸消毒可對樣本外包裝進行消毒而不破壞樣本本身。

3.4 自控系統

自控系統主要由PLC控制模塊、顯示屏、壓差傳感器、密閉閥執行器、變頻器、照明、加熱模塊、溫濕度傳感器、報警模塊、開關、電源等組成。自控系統可控制排風機的啟停、密閉閥開關、壓差、溫度、照明、報警等，并可實時記錄隔離器內環境參數。由壓差傳感器、變頻器、風機與隔離器內壓差構成閉環控制回路，可根據隔離器內實時壓差自動調節風量時刻保持壓差恒定在設定值。由加熱模塊、溫濕度傳感器與隔離器排風溫度構成閉環控制回路，可根據隔離器排風溫度實時調節加熱模塊，可滿足不同日齡的禽類對環境溫度的要求。溫濕度傳感器安裝在生物密閉閥和風機之間的管路上，可有效避免在隔離器消毒過程中消毒劑對傳感器的化學腐蝕。照明由LED光源組成，可手動控制開關。報警系統可在壓差、溫度超出設定范圍后進行聲光報警。

3.5 消毒連接系統

消毒連接系統主要由消毒連接口、消毒循環管路組成。在排風管上設有消毒循環旁路，隔離器正常運行模式下，消毒循環旁路出口端是密閉的。在消毒模式下，隔離器進風口則轉換為消毒劑注入口，將消毒循環旁路的接口打開，作為消毒劑排出口，分別連接消毒機的進出口，同時生物密閉閥關閉。

3.6 污水收集系統

污水收集處理系統主要由排水槽、截止閥、污水排放管路、污水收集桶組成。污水排放管路靠近截止閥一端設置有消毒接口，消毒接口安裝有高效過濾器，高效過濾器另一端作為消毒劑的排出口。污水收集桶由桶身、桶蓋、消毒劑注入接口、污水注入口(兼作污水排放口)、截止閥組成。

4 隔離器消毒流程

對隔離器進行消毒是防止隔離器內病原微生物存活、增殖及向外擴散的有效手段和關鍵一環，主要包括隔離器箱體、高效過濾器、RTP傳遞桶以及污水收集桶的消毒。

4.1 隔離器整體消毒

隔離器整體消毒是在整個實驗周期結束后進行的，可對隔離器箱體內部及送排風高效過濾器進行整體消毒，通常采用氣(汽)體循環消毒方式。采用氣(汽)體循環消毒方式進行消毒時，將氣體消毒機消毒劑的輸出口通過管路連接至消毒劑注入口(隔離器進風口)，打開隔離器消毒接口，將消毒機的消毒劑回收口連接至氣體消毒劑排出口形成閉環消毒環路，然后開啟消毒機發生氣體消毒劑，對隔離器箱體內部及送、排風高效過濾器進行原位消毒；采用氣體一過式消毒方式時，則需將氣體消毒劑排出口通過消毒管路連接至所在實驗室排風系統或外環境，其他步驟同上；消毒結束后，取下隔離器的消毒管路，打開生物密閉閥，開啟隔離器通風系統對殘余消毒劑進行吹掃，吹掃結束后，取出生物指示劑進行培養驗證消毒效果，則整個消毒流程完成。見圖3。

注：箭頭表示氣流方向。圖3 隔離器氣體消毒原理圖Note. Arrows indicate the direction of airflow.Figure 3 Diagram showing principle of isolator gaseous disinfection

4.2 RTP傳遞桶消毒

4.2.1 不銹鋼傳遞桶

將污染物品放置在傳遞桶內，關閉傳遞門，并將傳遞桶從隔離器摘下后，需將傳遞桶直接放置在高壓滅菌器內進行整體高溫高壓消毒。

4.2.2 HDPE傳遞桶

將污染物品放置在傳遞桶內，關閉傳遞門，將傳遞桶從隔離器摘下后，將氣體消毒機的注入口和回收口分別連接至傳遞桶底部的消毒接口，進行氣體熏蒸消毒。

4.3 污水收集桶消毒

收集污水前，可先將消毒劑提前放置在污水收集桶內，然后將污水收集桶通過排水管連接至隔離器底部的排水口，打開排水口上部的截止閥，將隔離器內的污水排放至污水收集桶，但要控制水量避免將污水收集桶灌滿，以免污水外溢；污水排放結束后，關閉排水截止閥，將消毒機的氣體注入口連接至污水收集桶上的消毒接口，而氣體回收口則連接至污水排放段上的過濾器入口，構成消毒循環環路，進行氣體熏蒸消毒；消毒結束后，關閉污水收集桶上的截止閥，將排水管拆下，將污水收集桶的污水排放至特定的污水處理系統。

5 性能驗證

根據相關標準要求，隔離器的檢測項目主要包括：氣密性、換氣次數、靜壓差、空氣潔凈度、手套口風速、高效過濾器檢漏、噪聲、照度。目前，認可標準RB/T 199-2015《實驗室設備生物安全性能評價技術規范》[7]規定了氣密式動物隔離器的工作區氣密性要求，而對于安裝類似RTP傳遞桶這種脫卸式傳遞裝置其氣密性則沒有規定。GB/T 25915.7-2010《潔凈室及相關受控環境 第7部分:隔離裝置(潔凈風罩、手套箱、隔離器、微環境)》[10]要求傳遞裝置不應降低隔離裝置的性能，同時，對于可單獨使用的傳遞裝置其小時泄漏率不得大于其所服務的隔離裝置的小時泄漏率，換言之，傳遞裝置的氣密性不應降低隔離裝置的氣密性。且由于RTP傳遞裝置在傳遞高致病性病原微生物過程中存在泄漏風險，因此，RTP傳遞裝置本身的氣密性以及其安裝到隔離器并與隔離器構成一體后的氣密性均應滿足隔離器工作區的氣密性要求。

2016年10月，委托國家建筑工程質量監督檢驗中心對該型隔離器的整體性能進行了檢測。檢測結果如下：

(1)氣密性：在+1000 Pa下，隔離器工作區小時泄漏率為0.09%；在+1000 Pa下，隔離器與RTP傳遞桶構成一體后小時泄漏率為0.07%；在+1000 Pa下，隔離器與RTP傳遞桶構成一體后小時泄漏率為0.07%；在+1000 Pa下，RTP傳遞桶的小時泄漏率為0.07%；上述測試結果均遠高于RB/T 199-2015《實驗室設備生物安全性能評價技術規范》[7]中在250 Pa下小時泄漏率不超過0.25%的氣密性要求；

(2)換氣次數：不小于每小時30次；

(3)空氣潔凈度：達到5級；

(4)靜壓差：在負壓運行狀態下，隔離器內與房間的相對負壓符合安全柜標準中不小于120 Pa的要求；

(5)手套口風速：達到1.1 m/s，符合安全柜標準中不小于0.7 m/s的要求，可保證在手套意外脫落或破損時手套口的氣流流向明顯向內，無外逸；

(6)送風高效過濾器檢漏：采用掃描法對送風高效過濾器進行檢漏測試，邊框及濾芯均未見泄漏；

(7)排風高效過濾器檢漏：采用效率法對其進行檢漏檢測，并對結果進行95%置信度計算，對粒徑為0.3～0.5 μm粒子的過濾效率大于99.99%；

(8)噪聲：隔離器內部與外部噪聲均低于50 dB(A)，有效保證實驗動物福利要求和工作人員環境舒適性要求；

(9)平均工作照度：正常運行狀態下，平均工作照度符合安全柜標準中不低于650 lx的要求。

由此可見，所研制的該型禽負壓隔離器相關性能指標可滿足標準GB 14925-2010《實驗動物 環境及設施》[6]、RB/T 199-2015《實驗室設備生物安全性能評價技術規范》[7]、GB 50346-2011《生物安全實驗室建筑技術規范》[8]以及JG 170-2005《生物安全柜》[9]的相關要求，達到了設計要求。目前，該型禽負壓隔離器已在我國多家高等級生物安全實驗室示范應用，且均通過了國家建筑工程質量監督檢驗中心的檢驗，達到相關標準的要求。

6 結論

動物隔離裝置是高等級動物生物安全實驗室的硬件基礎，是保護工作人員與外環境的重要初級防護屏障之一。本文介紹了國產生物安全型禽負壓隔離器的研制概況，在國家重點研發計劃項目的資助下，有效解決了氣密防護、氣密傳遞、微環境控制、過濾器檢漏和消毒、廢棄物收集處理等關鍵技術問題。具有國家檢測資助的第三方機構檢測結果表明，所研制的禽負壓隔離器相關性能指標均可滿足相關標準及設計要求，可滿足生物安全實驗室開展高致病性感染禽類隔離飼養和實驗的重大需求；同時，與進口同類產品相比，自動化程度更高，安全性更好。該型隔離器的研制成功，打破了發達國家對高等級生物安全隔離裝備的技術壟斷，進一步提高了我國生物安全關鍵防護裝備的保障水平，將為我國實現實驗室生物安全裝備自主可控奠定更加堅實的基礎。