小麥α-醇溶蛋白體外克隆表達及脫酰胺改性對面條機械特性的影響

廖 蘭，張風麗，李章發，陳林萍，林維杰，楊彥紅，文曉艷，倪 莉

小麥是我國三大糧食來源之一[1]。小麥蛋白是小麥的副產物，主要由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成，被當作食品添加劑廣泛應用于食品領域[2-4]。麥醇溶蛋白對面團的延展性有重要影響，可分為4 種類型，即α-、β-、γ-和ω-醇溶蛋白[5-8]，其中α-醇溶蛋白毒性最大，是引起乳糜瀉的主要蛋白質[9-12]。由于小麥醇溶蛋白不同亞基類型和麥谷蛋白具有較高的分子同源性，因此用傳統分離純化方法分離出α-醇溶蛋白難度較大[13]。目前，利用大腸桿菌表達、提取蛋白，測定揉混實驗參數已經成為研究α-醇溶蛋白功能的重要方法。李敏[14]利用Escherichia coli體外表達表達得到α-醇溶蛋白，將其添加到基礎面粉中，利用粉質儀研究其對面團流變學特性影響，發現α-醇溶蛋白會使面團帶寬和機械耐力系數有所增加，而縮短面團的穩定時間和形成時間。劉國娟[15]發現α-醇溶蛋白可以縮短揉面時間并增加面團耐揉性。小麥面筋蛋白含有大量的疏水性氨基酸谷氨酰胺和天冬酰胺，導致其難溶于水，限制了其在食品行業上的應用[16]。脫酰胺改性可以將酰胺基轉化為羧基從而提高其溶解性[17]。Shih[18]、Liao Lan[19]和Wang Yongquan[20]等的研究發現酸可以更加有效地將酰胺基團轉變為羧基，從而改善小麥面筋蛋白的功能性質。Berti等[21]發現醋酸可以降低小麥蛋白的致敏性。本研究通過體外克隆表達的方法得到α-醇溶蛋白，利用檸檬酸對α-醇溶蛋白進行脫酰胺改性，并將其添加到面粉中，研究脫酰胺改性α-醇溶蛋白的結構變化對面條質地的影響，為進一步研究檸檬酸改性對α-醇溶蛋白致敏性的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pUC57-α-gliadin由實驗室保存；克隆和表達試劑、DNA凝膠回收純化試劑盒 大連寶生物工程有限公司；周麥28面粉 河南周園種業有限公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

VeritiTM96-well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）梯度擴增儀 Applied Biosystems（中國）科技有限公司；JS-680B全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；8210E傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；FluoroMax-4熒光分光光度計 法國Horiba Jobin Yvon公司；SH-4000掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 韓國HIROX公司。

1.3 方法

1.3.1 pUC57-α-gliadin轉化感受態細胞及序列分析

根據GenBank公布的α-醇溶蛋白基因編碼區兩端保守區設計1 對引物，引物序列為P1：5’-ATGAAGACCTTTCTCATCCTT-3’、P2：5’-GTTAGTACCGAAGATGCCAAATG-3’，將pUC57-α-gliadin轉化至DH5α，藍白斑篩選陽性菌。以陽性菌為模板進行PCR鑒定，以不含目的基因的DH5α為對照組，PCR產物用質量分數1%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）檢測鑒定后送測序公司進行DNA測序，采用NCBI在線BLAST進行序列同源性比對，用DNAMAN軟件翻譯DNA序列。

1.3.2 表達載體的構建和鑒定

根據目的序列完整編碼區，利用Primer Premier 5.0軟件設計1 對表達引物P3：5’-CGCCATATGGTTAGAGTT CCAGTGCCA-3’、P4：5’-CCGCTCGAGGTTAGTACCG AAGATGCCAAATG-3’，在上游引物P3、下游引物P4的5’端分別引入酶切位點Nde I和Xho I，以陽性質粒為模板擴增并回收目的基因。PCR產物于1% SDS-PAGE檢測后回收，回收的PCR產物及pET-22b（+）質粒分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，酶切片段經純化回收，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，連接產物轉化至DH5α，雙酶切鑒定陽性克隆后進行測序。

1.3.3 融合蛋白的表達和純化

陽性重組質粒pET-22b-α-gliadin轉入宿主細菌E. coli BL21（DE3）中，挑取單菌落接種在5 mL LB培養液中（含100 μg/mL氨芐青霉素），在37 ℃下振蕩培養過夜。按照1∶100的比例接種于新鮮液體LB培養基（含100 μg/mL氨芐青霉素）上，37 ℃振蕩培養至OD600nm值為0.6～0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為1 mmol/L，37 ℃下培養18 h，20 ℃、10 000 r/min離心5 min，收集菌體，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次。取部分菌體超聲破碎處理后進行SDS-PAGE分析。根據Arentz-Hansen等[22]的方法，用預熱至60 ℃的體積分數70%乙醇溶液重懸菌體，60 ℃下水浴2 h，菌懸液在20 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，進行SDS-PAGE分析。加入上清液2 倍體積的1.5 mol/L氯化鈉溶液，4 ℃下過夜沉降α-醇溶蛋白，離心收集沉淀，透析后冷凍干燥。

1.3.4 α-醇溶蛋白脫酰胺改性

根據Liao Lan等[19]的方法，配制含0.04 mol/L檸檬酸的α-醇溶蛋白懸浮液（質量分數1%），在水浴鍋中常溫水化8 h后放入滅菌鍋中121 ℃濕熱脫酰胺10 min，于4 ℃、9 500 r/min離心10 min后得到上清液，在4 ℃透析24 h除去鹽離子，凍干，得到脫酰胺改性的α-醇溶蛋白。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測定

根據Liao Lan等[23]的方法。稱取2 mg樣品及200 mg KBr，在干燥條件下研磨至均勻，壓片，全波段掃描（4 000～400 cm－1），用PeakFit v4.12軟件去卷積和二階求導，分析酰胺I帶區域（1 700～1 600 cm－1）圖譜二級結構含量。

1.3.6 內源性熒光掃描

根據Wu Haohao等[24]的方法，待測樣品溶于體積分數70%乙醇溶液中（1.0 mg/mL）。熒光分光光度計的測定條件為：激發波長295 nm，記錄300～400 nm波長范圍的發射光譜。

1.3.7 SEM觀察

SEM觀察根據李劍平[25]的方法。取干凈樣品臺，均勻貼上長度為3～4 mm的導電膠，粘取少量固體粉末涂抹在導電膠上。將樣品臺放入噴金儀器的真空室，開啟真空泵抽真空。待壓力達到2～4 Pa時開始噴金。電流為20 mA，時間為40 s。將樣品臺放入儀器真空室抽真空，待壓力適宜后打開鎢燈絲電源，開始觀察。

1.3.8 脫酰胺改性α-醇溶蛋白對面條質地影響的測定

根據劉國娟[15]和王靈昭[26]等的方法并作適當調整，分別在10 g面粉中添加20 mg脫酰胺改性和未改性α-醇溶蛋白，攪拌均勻后加入5.0 mL蒸餾水揉成面團，再制成面條，以未加入α-醇溶蛋白的面條作為對照，測定質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）指標。每次將3 根面條水平放置在載物臺上，每個樣品做6 組平行實驗。質構儀設定參數為：輕型刀片探頭；Compress模式；測試前速率0.8 mm/s，測試速率0.8 mm/s，測試后速率1 mm/s；測試距離為樣品75%厚度；感應力為Auto-5 g。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均進行平行實驗，而且重復2～3 次；樣品的測定均重復3～5 次，結果應用SPSS 13.0軟件中LSD多維分析法進行方差和顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.0軟件作圖。PCR結果用Image lab軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 pUC57-α-gliadin轉化及同源性分析結果

圖1 pUC57-α-gliadin轉化的平板藍白斑Fig. 1 Clones shown as blue or white plaques on a plate

由圖1可以看出，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖苷、IPTG和含氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養基上有明顯的藍白斑單菌落，可以初步判斷pUC57-α-gliadin成功轉化到了DH5α感受態細胞中。挑選單菌落進行PCR鑒定，經1.0% SDS-PAGE檢測，由圖2可以看出，泳道4、8、9在860 bp處出現了PCR產物，證明其為陽性克隆子。測序結果采用NCBI在線BLAST進行同源性分析，結果如表1所示，實驗所用α-gliadin序列廣泛存在于小麥基因組中，其最高同源性最高達到100%。

圖2 pUC57-α-gliadin PCR鑒定結果Fig. 2 Agarose electrophoresis pattern of PCR amplification products of pUC57-α-gliadin

表1 α-gliadin基因序列同源性分析Table 1 Homology analysis of α-gliadin nucleotide sequences

2.2 表達載體pET-22b-α-gliadin構建結果

連接產物轉化感受態細胞后，如圖3所示，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養基上可以長出白色單菌落，說明pET-22b-α-gliadin成功進入DH5α感受態細胞并使其產生氨芐抗性。挑選4 個單菌落進行PCR鑒定，經1.0% SDS-PAGE檢測，由圖4可以看出，泳道1～4在800 bp處出現目的片段。雙酶切結果（圖5）和測序結果證明其為陽性克隆子。

圖3 pET-22b-α-gliadin的轉化結果Fig. 3 Transformation of plasmid pET-22b-α-gliadin

圖4 pET-22b-α-gliadin陽性克隆子PCR鑒定Fig. 4 Agarose electrophoresis pattern of PCR amplification products of pET-22b-α-gliadin

圖5 陽性克隆子雙酶切鑒定Fig. 5 Agarose electrophoresis pattern of the double digested plasmid DNA

2.3 誘導表達產物SDS-PAGE分析結果

用DNAMAN軟件對表達蛋白氨基酸序列進行推導，氨基酸序列如下：MVRVPVPQLQPQNPSQQQPQEQVP LVQQQQFLGQQQPFPPQQPYPQPQPFPSQQPYLQLLPF LQPQLPYSQPQPFRPQQPYPQPQPQYSQPQQPISQQQQ QQQQQQQQQQQQQQQIIQQILQQQLIPCMDVVLQQH NIVHGKSQVLQQSTYQLLQELCCQHLWQIPEQSQCQA IHNVVHAIILHQQQKQQQQPSSQVSFQQPLQQYPLGQ GSFRPSQQNPQAQGSVQPQQLPQFEEIRNLALQTLPA MCNVYIPPYCTIAPFGIFGTNLEHHHHHH，預測的蛋白質分子質量為32.2 kDa。從圖6中可以看出，經過體積分數70%乙醇溶液提取后，在約32.0 kDa處出現一條明顯的條帶，這與Arentz-Hansen等[22]的結果相似，證明經過誘導后DE3表達出目的α-醇溶蛋白，且用體積分數70%乙醇溶液可以提純得到目的蛋白，為下一步的實驗提供了依據。

圖6 α-醇溶蛋白誘導表達產物的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expressed and purified α-gliadin

2.4 α-醇溶蛋白及其改性后二級結構變化

圖7 脫酰胺改性α-醇溶蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 7 Fourier transform infrared spectrum of deamidated α-gliadin

圖7 為α-醇溶蛋白經過檸檬酸脫酰胺改性前后的傅里葉變換紅外光譜圖。對α-醇溶蛋白的酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）帶進行分峰處理，能夠得到5 種蛋白二級結構特征峰（1 604、1 635、1 652、1 679、1 693 cm－1）。

從表2可知，經過檸檬酸脫酰胺改性后α-醇溶蛋白的α-螺旋含量由39.80%下降至33.50%，同時β-折疊結構含量由39.50%上升為52.30%，增加顯著，而β-轉角含量則從20.70%下降為15.40%。龍偉等[27]指出：蛋白質α-螺旋和β-折疊是存在于蛋白質內部的穩定規則結構，β-轉角較多地暴露在蛋白質表面，這使得抗體比較易于和β-轉角嵌合，其成為抗原表位的可能性也隨之提高；脫酰胺改性后α-醇溶蛋白的β-轉角含量下降，說明其成為抗原表位的可能性降低，因此降低α-醇溶蛋白的致敏性。α-螺旋的結構比較緊密且穩定，這不利于蛋白展現良好的功能特性所需要的構象變化[28]。β-折疊和β-轉角結構的緊密程度較差且構象穩定性也比α-螺旋結構差，但是它可以改善蛋白質的柔韌性，有利于蛋白質一些功能特性的發揮。α-螺旋/β-折疊的值反映了蛋白質分子柔韌性，比值小則蛋白質柔韌性高[29]。表2顯示α-醇溶蛋白經過檸檬酸脫酰胺改性后，α-螺旋/β-折疊由1.00降為0.64，說明檸檬酸脫酰胺改性提高了α-醇溶蛋白分子柔性。

表2 脫酰胺改性α-醇溶蛋白的二級結構含量變化Table 2 Secondary structure composition of deamidated α-gliadin

2.5 α-醇溶蛋白及其改性后內源性熒光變化

圖8 脫酰胺改性α-醇溶蛋白內源性熒光掃描圖Fig. 8 Endogenous fluorescence spectrum of deamidated α-gliadin

內源性熒光光譜主要由色氨酸殘基環境極性的變化確定，是監測溶液中蛋白質含量和蛋白質在界面處構象變化的靈敏方法[29]。如圖8所示，經過檸檬酸脫酰胺改性后，改性α-醇溶蛋的λmax從351.5 nm移動到355.3 nm，λmax向長波長方向移動，這是由于經脫酰胺處理后的蛋白結構部分展開，使內源色氨酸基團暴露在溶劑中，色氨酸殘基周圍的微環境極性增強。說明脫酰胺處理有利于α-醇溶蛋白構象的展開。

2.6 SEM觀察結果

醇溶蛋白是只含有分子內二硫鍵的單體蛋白質，由于沒有亞基結構和分子間二硫鍵，醇溶蛋白肽鏈之間通過氫鍵、疏水鍵和分子內二硫鍵連結，形成緊密的三維結構而呈球形[30]。圖9a中α-醇溶蛋白呈顆粒狀或球形，表面粗糙重疊在一起。圖9b中可以看出α-醇溶蛋白經過檸檬酸濕熱脫酰胺改性后，形成表面光滑均勻的塊狀。說明脫酰胺改性對α-醇溶蛋白作用效果非常明顯，使其結構發生了劇烈的變化。

圖9 脫酰胺改性α-醇溶蛋白SEM掃描圖Fig. 9 SEM photomicrographs of deamidated α-gliadin

2.7 α-醇溶蛋白及其脫酰胺改性后對面團質地的影響

為進一步探究檸檬酸脫酰胺改性α-醇溶蛋白對面條質地的影響，利用質構儀測定了添加α-醇溶蛋白和檸檬酸脫酰胺改性的α-醇溶蛋白的面團制成面條的TPA指標，以期對脫酰胺改性α-醇溶蛋白的應用提供參考。

表3 脫酰胺改性α-醇溶蛋白對面條質地的影響Table 3 Effect of deamidated α-gliadin on textural properties of noodles

如表3所示，總體而言，添加了α-醇溶蛋白的面條除了黏著性由（396.34±3.57）g·s降為（264.30±7.95）g·s外，對于其他參數，α-醇溶蛋白的添加影響有限。而對于添加了檸檬酸脫酰胺改性α-醇溶蛋白的面條，其硬度由（6 941.31±3.76）g下降為（6 063.64±4.88）g，黏著性提高至（486.71±6.59）g·s，同時，面條的膠著性下降了534.39 g，咀嚼性下降了637.16 g，降幅明顯；而面條的彈性、黏聚性以及回復性則沒有發生太大變化。這說明經過檸檬酸脫酰胺改性后，α-醇溶蛋白會提高面條的黏性而降低面條硬度，對于彈性的影響較小。

3 結 論

本實驗通過體外表達、分離純化得到小麥α-醇溶蛋白，研究了在檸檬酸濕熱脫酰胺處理10 min后小麥α-醇溶蛋白的分子結構的變化，以及改性后對面條質地的影響，主要得出以下結論：1）經過檸檬酸脫酰胺改性后，α-醇溶蛋白的α-螺旋和β-轉角結構含量降低，β-折疊結構的含量增加，α-螺旋/β-折疊下降，說明α-醇溶蛋白的分子柔性得到提高，有利于α-醇溶蛋白相關功能特性的發揮。2）脫酰胺改性后α-醇溶蛋白內源色氨酸暴露，蛋白結構展開，SEM觀察結果進一步說明脫酰胺改性使α-醇溶蛋白結構發生劇烈變化。3）TPA實驗結果表明，脫酰胺改性α-醇溶蛋白可以顯著提高面條的黏性而降低面條硬度，為α-醇溶蛋白的應用提供理論依據。以上結果表明，利用檸檬酸對α-醇溶蛋白進行脫酰胺改性改善了α-醇溶蛋白的功能性質，具有一定的理論價值和實際意義，可為開展α-醇溶蛋白致敏性研究提供參考。