魯氏酵母對米渣生醬油風味和抗氧化活性的增強效應

袁江蘭，陳曉敏，鐘文秀，康 旭

傳統醬油是以大豆、小麥和麩皮為原料釀造而成的調味品，其滋味鮮美，深受消費者歡迎。長期以來，大豆是生產醬油的不可或缺的主要原料，但是隨著蛋白質資源和醬油新產品的開發，一些高蛋白植物性原料，如玉米渣、核桃餅、面筋、米渣等成為釀造醬油的潛在資源[1-3]。

米渣是大米淀粉糖企業的主要副產品，其蛋白質量分數達60%左右，是濃縮的大米蛋白，具有氨基酸組成及比例合理、低抗原性等優點[4-5]，大米蛋白經適度降解后還具有一定的保健功能，如抗高血壓、降低膽固醇等[6]。米渣溶解性很差，因此應用非常有限，目前主要作為飼料，價值未得到充分體現。這一問題也引起了研究者的關注，近年來對其應用研究較多，主要集中在蛋白粉、活性肽、可食用膜及食品添加劑等方面[7-9]。米渣是釀造醬油的優質原料[10]，但仍然存在蛋白質利用率相對較低、風味不及大豆醬油等問題；多菌種耦合發酵是解決這些問題的有效方法，如魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）耦合發酵能賦予醬油良好滋味和香氣，細胞自溶后也可進一步增加醬油鮮味，魯氏酵母還可能對醬油的抗氧化活性產生貢獻。關于大豆醬油的抗氧化活性已有較多報道[11-15]，前期研究表明米渣醬油也具有明顯的抗氧化活性[10]，但其與菌種的相關性尚不清楚。本實驗系統探究魯氏酵母對米渣生醬油風味和抗氧化活性的影響，以期為提高米渣的應用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉HN3.042、黑曲霉AS3.350 上海佳民釀造食品有限公司釀造一廠；魯氏酵母 安琪酵母股份有限公司。

米渣 湖北德安府糖業有限責任公司；仲辛醇（色譜純）、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、羅丹明6G（高級純） Aladdin試劑（上海）有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

L-8900氨基酸自動分析儀、F-7000熒光分光光度計日本日立公司；2100可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；78-1 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 米渣生醬油樣品的制備

將米渣、麩皮、面粉、水以質量比6∶2∶2∶7.8的配比混合，經蒸料、冷卻、接種后，在32～35 ℃、相對濕度85%～90%的恒溫恒濕曲室中制曲36 h。制曲結束后，稱取成曲，裝入1 L密封罐中，添加2.5 倍質量鹽水混合制成鹽質量分數10.86%的稀醪，35 ℃恒溫發酵45 d，經過濾得生醬油。根據菌種及接種比例差異，實驗分組如下。

S1：接種0.2%米曲霉制曲；S2：接種0.16%米曲霉和0.04%黑曲霉，混菌制曲；S3：接種0.2%米曲霉制曲，發酵初始添加0.05%魯氏酵母混菌發酵；S4：接種0.16%米曲霉和0.04%黑曲霉混菌制曲，并在發酵初始添加0.05%魯氏酵母混菌發酵。

采用米曲霉（0.16%）和黑曲霉（0.04%）混菌制曲，制曲完成后，將成曲均分為3 份。C1：不添加魯氏酵母的對照組；C2：發酵初始時添加0.05%魯氏酵母；C3：醬醪發酵至pH 5.0時添加0.05%魯氏酵母。

采用米曲霉（0.16%）和黑曲霉（0.04%）混菌制曲，制曲完成后，將成曲均分6 份，醬醪發酵至pH 5.0左右時分別添加0.00%、0.01%、0.025%、0.05%、0.075%和0.100%魯氏酵母繼續發酵，記為Ⅰ～Ⅵ組。

1.3.2 基本理化指標測定

氨基酸態氮含量采用甲醛滴定法測定，參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》，還原糖含量測定參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》。

1.3.3 游離氨基酸含量測定

采用L-8900氨基酸自動分析儀測定生醬油中游離氨基酸含量。取適量生醬油樣品與等體積的10%磺基水楊酸溶液，混合均勻后于4 ℃下放置15 min，15 000 r/min離心15 min。取上清液用0.02 mol/L鹽酸稀釋200 倍，0.22 μm微孔濾膜過濾后上氨基酸自動分析儀檢測。衍生化試劑為茚三酮，反應柱柱溫135 ℃，柱壓0.982 MPa。

1.3.4 總酚含量測定

參考文獻[16]方法，略作修改。取1 mL樣品稀釋液加6 mL蒸餾水和1 mL福林-酚試劑混勻后，在5～8 min內加1.5 mL質量分數20% Na2CO3溶液，混勻后，75 ℃水浴保持2 h后在765 nm波長處測定吸光度。以0.1 mg/mL沒食子酸標準品繪制標準曲線，樣品中總酚含量以沒食子酸含量表示。

1.3.5 揮發性成分分析

5-甲基-2-乙基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮（2-ethyl-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone，EHMF）、4-乙烯基愈創木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）質量濃度采用頂空固相微萃取和GC-MS測定。

固相微萃取方法：取3 mL醬油樣品與2 mL蒸餾水于20 mL樣品瓶中，加入2 g NaCl，置于磁力攪拌器50 ℃水浴平衡15 min后，用固相微萃取頭萃取，頂空吸附35 min，解吸5 min，每個樣品重復3 次。

GC條件：19091S-433UI HP-5MS Ultra Inert型毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速1.0mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流；升溫程序為初溫40 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升溫到120 ℃保持2 min，再以7 ℃/min的速率升溫到220 ℃保持5 min。

MS條件：采集方式為掃描；溶劑延遲7 min；質量范圍35～395 amu；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI；離子源能量70 eV；接口溫度250 ℃。

對匹配度大于70（最大值100）的揮發性成分根據NIST 11和NIST EPA數據庫定性，采用面積歸一化法進行定量計算。

1.3.6 體外抗氧化活性測定方法

1.3.6.1 還原力

采用普魯士藍法[17]，以VC溶液的還原力作標準曲線對還原力進行定量，表示為每毫升樣品的還原力與VC溶液濃度的等同量，即μg VC/mL。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力

參考文獻[18]的方法。樣品稀釋200 倍進行測定并以VC溶液為陽性對照。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A樣品為等體積樣品稀釋液和DPPH乙醇溶液的吸光度；A對照為等體積樣品稀釋液和無水乙醇的吸光度；A空白為等體積水和DPPH乙醇溶液的吸光度。

測定5 個濃度梯度的樣品對DPPH自由基清除能力，經線性回歸后計算出DPPH自由基清除能力為50%時的醬油濃度，即半最大效應濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）（μL醬油/mL溶液）。

1.3.6.3 總抗氧化能力

采用ABTS法[19]，取2 mmol/L ABTS溶液50 mL與70 mmol/L K2S2O8溶液200 mL混合均勻，室溫避光放置12～16 h，得ABTS儲備液。用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）將ABTS儲備液稀釋，使其A734nm＝0.700±0.020。取0.2 mL樣品稀釋液與3.8 mL ABTS工作液混合均勻反應4 min后檢測其A734nm，ABTS+·清除能力與A734nm呈反比。以Trolox為陽性對照，并繪制標準曲線，樣品的總抗氧化能力用Trolox當量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.6.4 ?OH清除能力

采用羅丹明6G-Fenton體系熒光法[17]，在10 mL具塞比色管中，依次加入pH 4.8的磷酸鹽緩沖液0.5 mL 0.1 mg/L羅丹明6G溶液0.5 mL、1.0 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、0.03% H2O2溶液0.6 mL，加水至刻度，混勻，反應15 min。激發波長348 nm，發射波長550 nm，激發和發射狹縫寬度為5 nm，以不加Fenton試劑的體系為空白，其熒光強度為F0，0.3 mL樣品稀釋液與羅丹明6G-Fenton溶液體系的熒光強度記為F樣品，未加清除劑體系的熒光強度記為F，并以0.53 mg/mL VC溶液作陽性對照。?OH清除能力按式（2）計算。

式中：F樣品－F為樣品清除6G-Fenton體系?OH的量；F0－F為羅丹明6G-Fenton體系所產生的?OH的量。

1.3.7 生醬油組分的抗氧化活性測定

提取醬油色素[20]，生醬油與無水乙醇最佳體積比為1∶2.16，按1.3.6.2節方法測定DPPH自由基清除活性。

采用蒸餾萃取法提取生醬油揮發油，按1.3.6.2節方法測定DPPH自由基清除活性。

采用超濾膜分離技術截留分子質量小于10 kDa組分制成凍干粉，按1.3.6.2節方法測定DPPH自由基清除活性。

1.4 數據統計分析

應用Origin 9.3軟件對數據進行作圖和統計分析，顯著性分析采用SPSS 19.0軟件的Duncan test進行，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 米渣生醬油品質指標和抗氧化成分

表1 米渣生醬油關鍵質指標和抗氧化活性成分Table 1 Quality indicators and antioxidant components of raw soy sauces

由表1可知，S1～S4氨基酸態氮質量濃度均明顯高于GB/T 18186—2000《釀造醬油》中特級醬油（0.8 g/100 mL），以添加黑曲霉發酵的S2和S4醬油中的氨基酸態氮質量濃度最高，黑曲霉和米曲霉的協同作用提高了米渣蛋白的降解與轉化率。除還原糖外，其他各項指標均以S4最高。黑曲霉產酸性蛋白酶和淀粉酶的能力較強，有利于提高醬油中氨基酸態氮、總氨基酸含量、谷氨酸及還原糖的含量[22]。EHMF、4-VG是醬油中重要的特征香氣成分，其中，EHMF被認為是日式醬油中最芳香的成分之一[23-25]。4-VG可賦予醬油典型的醬香味，EHMF具有焦糖香味，同時還具有抑制腫瘤和抗氧化功能。EHMF由魯氏酵母、假絲酵母等經戊糖磷酸途徑或基于戊糖的美拉德反應而生物合成[26-27]。S3、S4的總氨基酸、谷氨酸、EHMF和4-VG質量濃度總體顯著高于S1、S2，表明魯氏酵母不僅與EHMF和4-VG的生物合成具有相關性，而且有利于提高發酵產品氨基酸質量濃度。

C2、C3的各項指標總體明顯高于C1（P＜0.05），尤以C3增加最為明顯，其中C3的EHMF和4-VG分別比C2約提高38.15%和33.98%。魯氏酵母最適pH值為4.5～5.0，米渣醬醪發酵初始pH值為5.83±0.05，對酵母生長繁殖和代謝有一定抑制作用，酵母易因高濃度鹽水而失活或自溶，醬醪中活酵母數量下降。

酵母接種量對氨基酸態氮質量濃度影響不明顯，總氨基酸、谷氨酸、抗氧化氨基酸和總酚質量濃度隨酵母添加量的增加呈現先增后減的趨勢，總氨基酸以Ⅲ為最高，Ⅱ和Ⅲ的谷氨酸、抗氧化氨基酸、總酚質量濃度均較高，表明魯氏酵母添加0.01%～0.025%較為適宜。EHMF和4-VG質量濃度均隨酵母添加量增加而增加，均明顯高于未添加組。

2.2 米渣生醬油揮發性成分

圖1 米渣生醬油主要揮發性成分Fig. 1 Major volatile components in raw soy sauces

由圖1可知，S1～S4的揮發性成分種類和質量濃度均有一定的差異，以S3的揮發性成分種類為最多，達57 種，其次是S4，但S4揮發性成分總質量濃度最高，約1 074.79 ng/mL，表明魯氏酵母耦合發酵顯著增加了風味物質的種類和含量。各樣品均以醛類物質質量濃度最高，S4的醛類物質質量濃度較S1提高了41.4%，其中對醬油風味有著關鍵作用的苯甲醛和苯乙醛質量濃度提高最為顯著，S4苯甲醛和苯乙醛較S1分別提高了72.47%和44.13%。苯乙醛及其相應的醇2-苯基乙醇來源于苯丙氨酸，事實上，蛋白質的新陳代謝和游離氨基酸的變化在醬油香氣的形成中扮演著重要的角色[28]，這可能也意味著魯氏酵母在氨基酸代謝方面的特點。S3、S4酸類物質質量濃度均顯著高于相應未添加魯氏酵母組，表明魯氏酵母明顯提高了醬油中的酸類物質質量濃度。

2.3 米渣生醬油體外抗氧化活性

圖2 米渣生醬油的體外抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activity of raw soy sauces

由圖2可知，S3、S4的4 種體外抗氧化活性均明顯高于相應的對照S1、S2，表明魯氏酵母在抗氧化活性方面具有一定作用。在其他發酵產品中酵母菌也表現出對抗氧化活性有突出貢獻[29]。魯氏酵母除了產生高濃度的多元醇外，還具有較強抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑的來源[30]。可見魯氏酵母在耦合發酵醬油的過程中具有多方面的有益作用。

圖3 酵母接種時期對米渣生醬油抗氧化活性的影響Fig. 3 Effect of Z. rouxii inoculation time on antioxidant activity of raw soy sauce

由圖3可知，魯氏酵母接種時期對米渣醬油的抗氧化活性也有影響。C2和C3的抗氧化活性均明顯高于C1，特別是C3顯著增加，還原力較C2醬油提高了約14.49%，DPPH EC50為3.17 μL/mL。因此當醬醪發酵至pH 5.0左右時添加魯氏酵母有利于提高米渣醬油的抗氧化活性。

由圖4A可知，與Ⅰ組相比，發酵初始7 d內各實驗組還原力迅速增加，且與魯氏酵母添加量存在明顯的量效關系。發酵1 周后，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的還原力增加明顯變緩，而Ⅰ和Ⅱ還原力依然平穩增加。還原力明顯受魯氏酵母添加量影響。由圖4B可知，魯氏酵母對DPPH自由基清除能力影響規律相似，發酵初始15 d，DPPH自由基清除率與魯氏酵母添加量呈正相關。表明抗氧化能力的增加與魯氏酵母的增殖和代謝有關，魯氏酵母的細胞數量和代謝產物對抗氧化有重要貢獻。

圖4 發酵期間米渣生醬油抗氧化活性的變化Fig. 4 Change in antioxidant activity of raw soy sauce during fermentation

2.4 醬油各組分的抗氧化活性

圖5 米渣生醬油組分（A）及還原型GSH（B）的DPPH自由基清除活性Fig. 5 DPPH radical scavenging effect of volatile oil, pigment and retenate with molecular mass less than 10 kDa from raw soy sauce (A)and reduced GSH (B)

如圖5A所示，在實驗添加量范圍內，揮發油與DPPH自由基清除率在明顯的量效關系，體積分數低于2.5%時，呈現良好的線性關系，體積分數2.5%時DPPH自由基清除率可達（89.13±0.73）%。米渣醬油色素主要通過褐變反應產生，在實驗添加量范圍內醬油色素與DPPH自由基清除能力存在線性關系，當色素質量濃度為4 mg/mL時，DPPH自由基清除率達（89.42±0.49）%。隨著醬油色素質量濃度增加，電子供體濃度增大，可結合更多的自由基形成穩定物質，從而中斷了自由基鏈式反應[31]。截留分子質量小于10 kDa的醬油組分凍干粉和DPPH自由基清除能力呈現明顯的線性關系，但是相同質量濃度下，還原型GSH清除DPPH自由基的能力明顯強于凍干粉。綜合分析表明米渣醬油揮發油、色素和較小的分子中均存在抗氧化活性成分，對米渣醬油抗氧化能力有重要貢獻。

3 結 論

魯氏酵母聯合曲霉發酵對增強米渣醬油風味和抗氧化活性有利，總氨基酸和揮發性成分質量濃度均明顯增加，特別是谷氨酸、EHMF和4-VG質量濃度增加顯著，同時各種體外抗氧化能力也得到明顯增強，有效改善了米渣醬油的品質。

利用魯氏酵母發酵米渣醬油，需掌握適宜的接種量和接種時間，在發酵至醬醪pH 5.0左右時添加約0.025%的魯氏酵母為宜。

米渣醬油抗氧化的化學本質并未探明，但初步的研究表明其揮發性成分、色素和截留分子質量小于10 kDa的組分具有較強的抗氧化活性。