葡萄糖-牡蠣酶解液美拉德反應體系的抗氧化活性

劉海梅，陳 靜，郝良文，于 慧

牡蠣又名生蠔，是我國主要的經濟貝類之一，也是我國四大養殖貝類之一[1]，營養價值高，富含蛋白質，是一種高蛋白的食品[2-4]。已有研究學者利用其富含的蛋白質制備酶解液，發現牡蠣酶解液具有一定的抗氧化活性[5-6]。美拉德反應是廣泛存在于食品加工與貯藏過程中的一種非酶褐變反應，其利用食品中存在的羰基（主要來源于糖或油脂氧化酸敗所產生的醛和酮）和氨基化合物（主要來源于胺、氨基酸、肽和蛋白質）發生羰氨反應，生成美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）。MRPs不僅能提供給食品芳香風味和色澤，而且具有抗氧化、抗誘變、抗病毒、抑菌、抗過敏、保護心血管疾病和預防腸道炎癥等生理功能[7-14]。已有研究表明，美拉德反應能顯著增強肽和蛋白質的抗氧化活性，木糖-草魚肽反應的MRPs[15]、大豆分離蛋白和金帶細鲹魚肉蛋白酶解物與葡萄糖反應生成的MRPs[16-17]等的抗氧化活性均高于相應的肽和蛋白質。因此，利用蛋白質、肽、氨基酸和還原糖制備具有抗氧化活性的MRPs[18-21]已成為國內外研究的熱點。

研究發現，MRPs的抗氧化強度可以與食品中常用的抗氧化劑媲美[22]，一些MRPs可以替代酚類食用抗氧化劑[23-24]。MRPs是食品加工和貯藏過程中自身產生的一類物質，被認為是天然物質，利用美拉德反應產生的抗氧化劑屬于天然抗氧化劑，尋找具有高活性的天然抗氧化劑代替商業抗氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，將極大地保障食品質量與安全。MRPs的抗氧化活性會因美拉德反應的反應底物和反應條件的不同而產生較大差異，本研究擬以牡蠣酶解液為原料，與葡萄糖建立美拉德反應體系，優化美拉德反應體系的反應條件，提高MRPs的抗氧化活性，從而為天然抗氧化劑的開發和牡蠣深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas） 煙臺振華量販超市魯東大學店；Protemax復合蛋白酶（酶活力1.5 AU/g）諾維信憶諾聯創生物科技（北京）有限公司；葡萄糖上海市藍季生物有限公司；二甲基硅油 國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

721G紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；AR224cn數顯電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-2集熱式恒溫磁力攪拌器（油浴鍋）金壇市白塔金昌實驗儀器廠；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；JJ-2B組織勻漿搗碎機 金壇市榮華儀器制造有限公司；PB-10普及型pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備流程

新鮮牡蠣肉→加水調整料液比為1∶5（m/m）→高速組織搗碎機搗碎→自然pH值→加入復合蛋白酶（30 AU/kg）→50 ℃恒溫酶解4 h→100 ℃滅酶15 min→冷卻→離心（5 000 r/min、15 min）→取上清液→酶解液[25]。

1.3.2 葡萄糖質量分數對MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中加入不同質量的葡萄糖，使葡萄糖的質量分數分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%，在自然pH值下100 ℃加熱反應90 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，測定不同葡萄糖質量分數下MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.3 反應溫度對MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中添加質量分數為5%的葡萄糖，在自然pH值下，分別在90、100、110、120、130、140 ℃條件下加熱反應90 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，測定不同反應溫度MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.4 反應時間對MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中添加質量分數為5%的葡萄糖，在100 ℃、自然pH值下，分別加熱反應30、60、90、120、150、180 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，測定不同反應時間下MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.5 pH值對MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中添加質量分數為5%的葡萄糖，分別調節pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在100 ℃下加熱90 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min。取上清液，測定不同pH值下MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.6 MRPs抗氧化活性為指標的美拉德反應條件正交試驗設計

根據單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗對美拉德反應條件進行優化。正交試驗的因素水平如表1所示。

表1 美拉德反應條件正交試驗因素水平表Table 1 Code and level of independent variables used in orthogonal array design for Maillard reaction conditions

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

移取2 mL樣液，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后于室溫下避光反應30 min，測定在517 nm波長處的吸光度。將2 mL DPPH乙醇溶液與2 mL磷酸鹽緩沖液混合液作為對照組；2 mL樣品與2 mL乙醇混合液作為空白組[26]。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A1為實驗組的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為對照組的吸光度。

1.3.8 金屬離子螯合能力的測定

移取2 mL樣液，加入2.7 mL蒸餾水和0.1 mL 0.02 mmol/L FeCl2溶液，再加入0.2 mL、5 mmol/L菲洛嗪溶液，在漩渦混合儀上混勻后室溫下反應10 min，于562 nm波長處測定吸光度。用蒸餾水代替樣品溶液作為對照組，用蒸餾水代替菲洛嗪溶液作為空白組[27]。金屬離子螯合能力的計算如式（2）。

式中：A1為實驗組的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為對照組的吸光度。

1.3.9 還原能力的測定

取樣液1 mL（體積分數95%乙醇作為空白），加入2.5 mL 0.2 mol/L的pH 6.6磷酸鹽緩沖液與2.5 mL質量分數1%鐵氰化鉀的混合溶液，于50 ℃恒溫水浴30 min，再加入2.5 mL質量分數10%的三氯乙酸，于3 000 r/min離心分離10 min，取上層清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.5 mL質量分數0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后，測定700 nm波長處吸光度，即為還原能力[27]。

1.4 數據處理與分析

采用Excel、SAS 8.1統計軟件對數據進行分析處理及圖表的制作，采用最小顯著性差異法進行方差分析，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖質量分數對MRPs抗氧化活性的影響

圖1 葡萄糖質量分數對DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 1 Effect of glucose addition on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖2 葡萄糖質量分數對還原能力的影響Fig. 2 Effect of glucose addition on reducing power

如圖1、2所示，葡萄糖質量分數對MRPs抗氧化活性的影響呈現先增加后降低的趨勢。葡萄糖質量分數為2%時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力均為最低，分別是53.38%、10.54%、0.893。葡萄糖質量分數增加至4%時，3 種抗氧化活性指標急劇增高，分別為63.50%、13.90%、1.229，繼續增加葡萄糖質量分數至10%，3 種抗氧化活性指標均逐漸減弱。經過方差分析，葡萄糖質量分數為4%時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力顯著高于其他質量分數（P＜0.05），且不同葡萄糖質量分數下的MRPs抗氧化活性指標均存在明顯差異。經美拉德反應后，MRPs的DPPH自由基清除率明顯高于韋海勝等[5]報道的牡蠣酶解液的26%，說明經美拉德反應后，產物的抗氧化活性明顯增加。

綜合分析，葡萄糖質量分數為4%時，MRPs的DPPH自由基清除能力、金屬離子螯合能力以及還原能力均達到最大值，因此，適宜的葡萄糖質量分數為4%。

2.2 反應溫度對MRPs抗氧化活性的影響

圖3 反應溫度對DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖4 反應溫度對還原能力的影響Fig. 4 Effect of reaction temperature on reducing power

溫度直接影響MRPs的抗氧化活性[26-28]。如圖3、4所示，溫度由90 ℃升至120 ℃時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力逐漸增加至最高值，分別達到81.8%、13.0%、1.250；繼續增加溫度至130、140 ℃時，3 種抗氧化活性指標水平先降低再上升，但數值均低于120 ℃時。經過方差分析，溫度為120 ℃時的MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力顯著高于其他溫度（P＜0.05），且不同溫度下的MRPs抗氧化活性指標均存在明顯差異。章銀良等[29]發現，隨著溫度的升高，酪蛋白-木糖模式MRPs的DPPH自由基清除率增加。趙晶等[30]研究酪蛋白-葡萄糖MRPs、酪蛋白-乳糖MRPs產物抗氧化活性時也發現，隨著溫度的升高，MRPs的DPPH自由基清除率增加。本研究結果與報道基本一致。

綜合分析，在溫度為120 ℃時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力均達到最大值，因此，適宜的反應溫度為120 ℃。

2.3 反應時間對MRPs抗氧化活性的影響

圖5 反應時間對DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 5 Effect of reaction time on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖6 反應時間對還原能力的影響Fig. 6 Effect of reaction time on reducing power

如圖5、6所示，反應時間從30 min延長至120 min時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力整體呈增加趨勢，在120 min時達到最大值，分別為84.09%、8.68%、1.216。但隨著反應時間延長至150、180 min，DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力均不同程度下降。經過方差分析，反應時間為120 min時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力、還原能力顯著高于其他時間的（P＜0.05），不同反應時間下的DPPH自由基清除率均存在顯著差異（P＜0.05），反應時間為30、180 min下的金屬離子螯合能力和還原能力沒有顯著差異（P＞0.05），其他不同反應時間下均存在明顯差異。趙謀明等[15]研究木糖-草魚肽美拉德反應體系時發現，具有強還原性的物質易在美拉德反應中產生，但隨著美拉德反應的進行，長時間加熱可能會使此類物質產生分解，從而導致MRPs還原能力增強趨勢變緩。本研究發現，長時間加熱會引起強還原性物質分解，從而導致MRPs還原能力有一定程度的降低。

綜合分析，在反應時間為120 min時，MRPs的自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力達到最大值，因此，適宜的反應時間為120 min。

2.4 反應pH值對MRPs抗氧化活性的影響

圖7 pH值對DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 7 Effect of reaction pH on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖8 pH值對還原能力的影響Fig. 8 Effect of reaction pH on reducing power

pH值是美拉德反應的重要影響因素，能夠直接影響美拉德反應的進程[27,29]，從而影響抗氧化活性物質的生成。如圖7、8所示，美拉德反應體系的pH值由5.5上升至7.0，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力隨pH值的增加整體呈現升高趨勢，pH 7.0時達到最高，分別為76.54%、25.82%、1.259，pH值上升至8.0的過程中則不斷下降。經過方差分析，pH 7.0時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力、還原能力顯著高于其他pH值（P＜0.05），pH 7.5、8.0下的DPPH自由基清除率不存在顯著差異（P＞0.05），除此之外，其他不同pH值下的DPPH自由基清除率均存在顯著差異（P＜0.05）；pH 5.5、6.5及pH 6.0、7.5下的金屬離子螯合能力不存在顯著差異（P＞0.05），但pH 6.0、7.5下的金屬離子螯合能力顯著高于pH 5.5、6.5；pH 5.5、6.5下的還原能力不存在顯著差異（P＞0.05），其他不同pH值下的還原能力均存在顯著差異（P＜0.05）。綜合分析，在pH 7.0時，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力達到最大值，因此，適宜的反應pH值為7.0。

2.5 以MRPs抗氧化活性為指標的美拉德反應條件的優化

表2 以MRPs抗氧化活性為指標的美拉德反應條件正交試驗優化結果Table 2 Orthogonal array design with experimental values of antioxidant activity

對葡萄糖質量分數、反應溫度、反應時間以及pH值進行4 因素3 水平的正交試驗優化，經極差分析得到各因素對MRPs抗氧化活性的影響。由表2可知，對DPPH自由基清除率而言，各因素對抗氧化活性影響的大小順序為B＞C＞A＞D，最優條件為A2B2C2D3，即葡萄糖質量分數4%、反應溫度120 ℃、pH 7.0、反應時間150 min；對于金屬離子螯合能力而言，各因素對抗氧化活性影響的大小順序為D＞A＞C＞B，最優條件為A1B3C2D2，即葡萄糖質量分數2%、反應溫度130 ℃、pH 7.0、反應時間120 min；對于還原能力而言，各因素對抗氧化活性影響的大小順序為A＞C＞B＞D，最優反應條件為A3B3C3D2，即葡萄糖質量分數6%、反應溫度130 ℃、pH 8.0、反應時間120 min。綜合分析葡萄糖質量分數、反應溫度、反應時間以及pH值4 個因素對MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力、還原能力3 個抗氧化活性指標的影響，確定抗氧化活性最強的反應條件為A2B2C2D2，即葡萄糖質量分數4%、反應溫度120 ℃、pH 7.0、反應時間120 min。

2.6 抗氧化活性驗證實驗

在牡蠣酶解液中添加4%的葡萄糖，調整pH值為7.0，于120 ℃下進行美拉德反應120 min后，得到MRPs，測定其DPPH自由基清除率為93.2%，金屬離子螯合能力為22.5%，還原能力為1.436，優于正交試驗結果，證明選擇優化的結果可靠。

3 結 論

牡蠣酶解液與葡萄糖建立美拉德反應體系，通過單因素試驗和正交試驗設計，研究葡萄糖質量分數、反應溫度、pH值、反應時間4 個因素對MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力的影響，優化了MRPs產生較強抗氧化活性的條件，反應條件為葡萄糖質量分數4%、反應溫度120 ℃、pH 7.0、反應時間120 min。在此條件下進行美拉德反應，得到的MRPs的DPPH自由基清除率為93.2%、金屬離子螯合能力為22.5%、還原能力為1.436。