品種和成熟度對油橄欖鮮果功效成分及抗氧化能力的影響

熊政委，謝躍杰，黃梅桂，趙富昌，王仲明，任貴禮，王 強,*

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院，重慶 400067；2.重慶第二師范學院，脂質資源與兒童日化品協同創新中心，重慶 400067；3.南京林業大學輕工與食品學院，江蘇 南京 210037；4.重慶江源油橄欖開發有限公司，重慶 404100）

油橄欖屬木犀科木犀欖屬常綠喬木，又名洋橄欖、齊墩果，是世界四大木本油料植物之一，主要分布于甘肅、重慶、云南、四川等地區[1]。油橄欖是一種高經濟效益的樹種，其綜合利用價值較高，主產品為橄欖油，具有抗氧化、抗菌、抗癌等功效，享有“食用植物油皇后”的美譽；油橄欖鮮果還可加工成藥用或餐用油橄欖，作為藥材或蔬菜食用[2]；其榨油后的果渣可作提取載體、飼料、肥料或燃料[1,3]。近年來，研究發現油橄欖葉提取物具有抗氧化、降血糖、降血壓、抗動脈粥樣硬化作用[4-5]。自古以來，由油橄欖果制作的產品就被作為食物和傳統藥物使用[6]。油橄欖鮮果皮肉細嫩、清香適口，含有較豐富的營養成分，可以作為餐用蔬菜；同時，《滇南本草》中提到橄欖“治一切喉火上炎，大頭瘟癥，能解濕熱，生津止渴，利痰，解魚毒、酒、積滯”[7]。現代營養學研究發現，油橄欖鮮果含有豐富的酚酸類、黃酮類、裂環烯醚萜類（包括橄欖苦苷（oleuropein，OL））、維生素及色素類等生物活性成分[8]。

目前，關于油橄欖鮮果的研究主要集中于鮮果中黃酮類和多酚類化合物的提取和分析。鄧俊琳等[9]建立了測定油橄欖鮮果中沒食子酸、羥基酪醇（hydroxytyrosol，HT）、對香豆酸、蘆丁、OL和槲皮素6 種多酚化合物含量的高效液相色譜方法；并研究了不同成熟度對蛋白質、還原糖、粗脂肪、總多酚含量的影響[10-11]。Salvador等[12]的研究發現，收獲時間對橄欖油產量、品質、穩定性、感官特性有重要影響。影響橄欖油鮮果中化合物的組成及含量的因素很多，如遺傳因子、氣候因子、土壤因子、加工手段、采收時間等[13-19]。但迄今為止關于多個不同油橄欖鮮果品種及成熟度對其主要功效成分（總酚（total phenol，TP）、總類黃酮（total flavonoid，TF）、總黃烷-3-醇（total flavanols，TFL）、OL、HT）的報道還很少。因此，為評價油橄欖鮮果藥用和食用價值，本研究對具有代表性的10 個品種進行功效成分分析；通過比較分析不同品種及成熟度（早、中、晚，分別記為I、II、III）油橄欖鮮果的功效成分和抗氧化能力，評價不同品種及成熟度間的品質差異性，對橄欖品種的選育及采后加工具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試油橄欖鮮果采集于重慶、甘肅隴南油橄欖種植示范基地。實驗采用完全隨機設計，選取不同株生長健壯、長勢一致的果樹為試材，共選取長勢良好、產量較穩定的10 個品種：白橄欖、豆果、鄂植、佛奧、卡林、科拉蒂、克羅萊卡、皮瓜爾、云臺、配多靈，分別在早、中、晚（即I、II、III）成熟期采摘于油橄欖種植基地，每個品種選取3 株生長健壯、長勢一致的5 年生樹為試材。

兒茶素、焦性沒食子酸、1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、L-抗壞血酸、福林-酚、水溶性VE（Trolox）、p-二甲氨基肉桂醛（p-dimethylaminocinnamaldehyde，p-DMACA）、乙腈（色譜純） 美國Spectrum公司；其他化學試劑均為國產分析純；所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

1.2 儀器與設備

AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JYL-C012料理機 九陽股份有限公司；高壓均質機 上海申鹿均質機有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 油橄欖鮮果原料預處理與提取

油橄欖鮮果的取樣根據GB/T 8855—2008《新鮮水果和蔬菜 取樣方法》[20]。將油橄欖果實去核，加液氮研成粉末，－80 ℃貯存備用。準確稱取200 g粉末，加入體積分數80%甲醇溶液，超聲提取25 min后，于4 ℃條件下5 000 r/min冷凍離心20 min，上清液即為油橄欖鮮果提取物，低溫保存備用。

1.3.2 不同品種及成熟度油橄欖鮮果TP、TF、TFL、OL、HT含量的測定

TP含量的測定采用福林-酚法[21]，以焦性沒食子酸-乙醇溶液（10～150 mg/L）作標準曲線，以每克鮮果粉末含有沒食子酸質量表示（μg/g）。TF含量采用三氯化鋁比色法測定[22]，以每克鮮果粉末含有兒茶素質量表示（μg/g）。TFL含量采用p-DMACA法測定[23]，以每克新鮮樣品含有兒茶素質量表示（μg/g）。OL和HT含量均采用色譜法測定[24-25]，均以每克鮮果粉末含有測試物質量表示（μg/g）。

OL含量測定的超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）條件[24]：UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×1.0 mm，1.7 μm)，柱溫30 ℃；流動相：乙腈-水（21∶79，V/V）；檢測波長230 nm；紫外檢測器；流速1 mL/min。準確稱取OL標準品7.88 mg，以甲醇定容至5 mL，混勻，配成質量濃度為1.576 mg/mL的溶液；分別移取80、155、235、315、395 μL溶液用甲醇定容至5 mL。以峰面積對質量濃度繪制標準曲線，計算OL含量，回歸方程為y＝6.217×10－8x（R2＝0.999 1）。

HT含量測定的UPLC條件：UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×1.0 mm，1.7 μm)；流動相：A為體積分數0.2%甲酸-乙腈溶液，B為體積分數0.2%甲酸-水溶液；流速0.15 mL/min；進樣量2.0 μL；柱溫35 ℃；激發波長為300 nm，發射波長為350 nm；洗脫梯度：0～5.0 min，5%～8% A；5.0～8.0 min，8%～80% A；8.0～9.0 min，80%～5% A；平衡2.0 min。準確稱取HT標準品1.20 mg，加體積分數12%甲醇-磷酸溶液定容，混勻，配成質量濃度為120 μg/mL溶液；按對半稀釋法分別配制3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 μg/mL溶液，以峰面積對質量濃度繪制標準曲線，計算HT含量，回歸方程為y＝2.462×10–5x－1.302×10－5（R2＝0.998 9）。

1.3.3 不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物抗氧化能力的測定

1.3.3.1 FRAP的測定

鐵離子還原能力（ferric reducing/antioxidant power，FRAP）參考Benzie等[26]的方法。取500 μg油橄欖鮮果提取物，加入1.8 mL 2,3,5-氯化三苯基四氮（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）工作液（由25 mL 0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液組成），混勻后37 ℃反應15 min，測定吸光度A593nm，以1.0 mmol/L FeSO4為標準溶液，樣品FRAP以每100 g鮮果粉末達到同樣吸光度所需FeSO4的物質的量表示（mmol/100 g）。

1.3.3.2 清除DPPH自由基能力的測定

清除DPPH自由基能力參考Liu Lixiang等[27]的方法進行測定，將4 mL 95% DPPH-乙醇溶液（10－4mol/L）與油橄欖鮮果提取物500 μg混勻后測定吸光度A517nm，以Trolox為標樣做標準曲線計算，DPPH自由基清除能力，回歸方程為y＝3.526x－1.423（R2＝0.999 1），結果以每100 g鮮果粉末含有Trolox物質的量表示（mmol/100 g）。

1.3.3.3 清除·OH能力的測定

清除羥自由基（·OH）能力的測定參照孫瑾等[28]的方法并略有修改。在比色管中依次加入1 mL 10 mmol/L FeSO4、1 mL 10 mmol/L水楊酸、油橄欖鮮果提取物500 μg，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37 ℃反應0.5 h，以蒸餾水作參比，在510 nm波長處測吸光度，并同時做不加FeSO4的空白樣品；以Trolox為標準品作標準曲線，計算·OH清除能力，回歸方程為y＝2.566x－1.602（R2＝0.999 0），結果以每100 g鮮果粉末含有Trolox物質的量表示（mmol/100 g）。

1.3.3.4 清除O2－·能力的測定

清除超氧陰離子自由基（O2－·）能力的測定參照孫瑾等[28]的方法并略有修改。取油橄欖鮮果提取物0.1 mg，加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）2.8 mL混勻，25 ℃水浴10 min后加入3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25 ℃水浴預熱）0.1 mL，混勻后迅速在420 nm波長處測定吸光度，每隔30 s讀取A420nm，5 min后結束。以去離子水0.1 mL和0.1 mol/L Tris-HC1緩沖液（pH 8.2）2.8 mL調零；空白對照管以去離子水代替油橄欖鮮果提取物。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按下式計算O2－·清除率。

1.4 數據統計分析

實驗數據以 ±s表示，用Duncan法進行差異顯著性檢驗，以P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 8.0軟件作圖。采用SPSS 16.0軟件進行各元素間相關性分析（correlation analysis，CA），因多數變量不服從正態分布，故采用Spearman等級相關系數法。采用SAS 8.2軟件中PRINCOMP過程對數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 品種及成熟度對油橄欖鮮果TP、TF、TFL、OL、HT含量的影響

圖1 品種及成熟度對油橄欖鮮果功效成分的影響Fig. 1 Effects of cultivar and maturity on functional composition content in fresh olive fruits

由圖1可知，在整個成熟過程中，對于同一個品種的鮮果而言，不同成熟度時TP和OL含量相對穩定，分別介于（1 080.63±24.33）～（2 434.75±11.89）μg/g之間和（790.47±21.89）～（1 867.62±19.67）μg/g之間，不同成熟度之間其差異較小；TP含量最高的為第II成熟階段白橄欖品種，含量最低的為第II成熟階段云臺品種；OL含量最高的為第III成熟階段皮瓜爾品種，含量最低的為第II成熟階段佛奧品種。

在整個成熟過程中，僅白橄欖、豆果、鄂植和配多靈4 個品種的TF含量變化較大，其中第I成熟階段白橄欖品種TF含量最高，達到（1 824.7±42.37）μg/g；僅皮瓜爾和配多靈2 個品種的TFL含量變化較大，其中第III成熟階段皮瓜爾品種TFL含量最高，達到（380.86±6.21）μg/g。不同品種及成熟度對油橄欖鮮果HT含量的整體影響與TP、TF、TFL和OL含量不同，各品種和不同成熟階段鮮果中HT含量波動較大，介于（413.30±12.34）～（983.96±32.15）μg/g之間。

2.2 不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物的抗氧化能力分析

圖2 不同品種及成熟度對油橄欖鮮果提取物的抗氧化能力的影響Fig. 2 Effects of cultivar and maturity on antioxidant capacity of fresh olive fruit extracts

由圖2可知，隨著成熟度的增加，油橄欖鮮果提取物的抗氧化能力呈現增強趨勢，但是O2－·清除率無此規律。第III成熟階段的白橄欖、豆果、皮瓜爾和配多靈品種FRAP較強（均大于1.2 mmol/100 g）；第III成熟階段的白橄欖、豆果、佛奧、卡林、皮瓜爾品種DPPH自由基清除能力較強（均大于1.75 mmol/100 g）；第III成熟階段的白橄欖、豆果品種?OH清除能力較強（均大于1.6 mmol/100 g）；除了配多靈品種，油橄欖鮮果提取物清除O2－·的能力均隨著成熟度增加而總體呈現增強的趨勢（第II成熟階段略有波動），其中卡林、克羅萊卡、皮瓜爾清除O2－·的能力較強。

2.3 油橄欖鮮果提取物中功效成分含量與抗氧化能力的相關性分析

表1 不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物中功效成分含量與抗氧化能力的相關性Table 1 Correlation between functional composition and antioxidant capacity of fresh olive fruit extracts from different cultivars at different harvest dates

表1相關矩陣分析顯示，油橄欖鮮果提取物FRAP與TF、TFL和OL含量呈顯著正相關（P＜0.05）；其DPPH自由基清除能力與HT含量呈顯著正相關（P＜0.05）；其?OH清除能力與各功效成分含量均呈顯著正相關（P＜0.05）（除TFL含量）；其O2－·清除率與TF、TFL和OL含量均呈顯著正相關（P＜0.05）。

2.4 橄欖鮮果提取物中功效成分含量與抗氧化能力的PCA結果

PCA可以用于解釋和分析多維樣品之間的差異，從而進一步分析“相似多維變量”之間的差異[29-31]。本實驗通過對不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物的功效成分與抗氧化能力的數據進行分析，根據特征值大于1的原則提取了3 個主成分（PCs），其方差貢獻率分別為43.42%、25.62%和9.52%，前2 個PCs數據反映了原始數據提供信息總量的78.56%。因此，將這2 個PCs作為評價所采集的樣品質量的綜合變量，通過PC1-PC2散點圖即可直觀了解各個品種及其成熟度的聚類程度及分布（圖3）。

圖3 不同品種及成熟度油橄欖鮮果的PC1/PC2主成分散點圖Fig. 3 PCA scatter plot of PC1 vs. PC2 for fresh olive fruits from different cultivars at three harvest dates

3 討 論

油橄欖果作為一種綜合利用價值較高的木本油料，有著巨大的開發利用空間。鄧俊琳等[11]的研究發現，8 個油橄欖品種（皮瓜爾、佛奧、克羅萊卡、卡林、鄂植、云臺、配多靈、科拉蒂）的總黃酮含量隨成熟度增加呈現先下降后略有上升的變化趨勢；隨著成熟度的增加，皮瓜爾品種TP含量先降低后趨于平穩，這與本研究結果差異較大。究其原因在于，油橄欖果中黃酮類和多酚類化合物的積累、轉化、降解是一個復雜的過程，其結果受品種、成熟度、產地、采樣時間等諸多因素的影響，因此產地識別對橄欖果實具有重要研究價值。

朱慶平[29]、龍偉[32]、張東[33]等研究了我國8 個品種（鄂植8、城固32、皮削利、萊星、佛奧、阿貝奎納、皮瓜爾和奇跡）油橄欖果及初榨橄欖油的品質，主要包括果實成熟度、大小、鮮果率、含水率、含油率以及橄欖油中脂肪酸組成、甘油三酯組成、生育酚、角鯊烯及甾醇等含量，結果發現，油橄欖果實中的金屬元素及角鯊烯等成分含量在不同品種之間存在著遺傳差異，這種差異也可作為油橄欖品種鑒定和分類的重要參考依據。功效成分的含量是評價油橄欖果品質及其特性的重要指標，筆者認為，皮瓜爾、克羅萊卡的OL含量總體較高，可作為特殊用途油橄欖品種。對于油橄欖果實的研究今后還需要建立品種及成熟度對油橄欖鮮果金屬元素、全成分、功能、品質等指標影響的指紋圖譜及譜庫，從而為油橄欖副產物利用及品種培育提供參考。