體外消化和貯藏條件對粗壯脈紋孢菌孢子中類胡蘿卜素穩定性的影響

杜 佳，余誠瑋，陳 莉，鄧澤元，李 靜*

粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa）屬真菌門、子囊菌門（Ascomycoya）、子囊菌綱（Ascomycetes）、糞殼目（Sordariales）、糞殼菌科（Sordariaceae）、脈紋孢菌屬（Neurospora），為粗壯串珠霉的有性世代，孢子團呈黃色或淡橙色[1]。粗壯脈紋孢菌作為模式生物在國內外主要用于基礎研究，如分子生物學、微循環產孢機制、生物鐘機制等；也有用其進行發酵產纖維素酶、乙醇、黑色素、漆酶、谷氨酸脫羧酶等產物的研究[2-3]。研究人員通過透射電子顯微鏡觀察粗壯脈紋孢菌的生長過程，發現粗壯脈紋孢菌的孢子中逐漸產生類胡蘿卜素，因而孢子呈現紅色或者橘黃色[4-6]。

類胡蘿卜素具有多種生理功能，如參與機體內的光和物質傳遞、抗光敏化、淬滅自由基、保護機體免受不利環境因素的損傷[7]。此外類胡蘿卜素還可以作為重要的營養素維生素的前體，可增強機體免疫力、延緩衰老、防癌抗癌、防治心血管疾病等，因而在醫藥、食品、飼料工業中都有廣泛的應用。楊風玲[8]報道粗壯脈紋孢菌孢子壁對孢子內的類胡蘿卜素具有較好的保護作用，但是，在消化過程中的生物利用率、抗氧化性以及貯藏條件對孢子中類胡蘿卜素的含量及其抗氧化能力的影響還不明確。因此本實驗擬研究粗壯脈紋孢菌孢子壁的組成成分，模擬體外消化過程研究孢子中類胡蘿卜素在消化過程中形態、含量、抗氧化能力的變化，并且探討不同貯藏條件對孢子中類胡蘿卜素的含量和抗氧化能力的影響，為包埋不穩定物質的壁材提供科學數據，為其在功能食品中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

粗壯脈紋孢菌CGMCC3088由南昌大學重點實驗室篩選分離；豆渣取自南昌市東北一家人飯店。

丙酮 西隴化學股份有限公司；濃鹽酸 天津市大茂化工試劑廠；氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DFT-20粉碎機 南京儀器廠；DZG-6020型真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；FA1104型電子天平上海精天電子儀器廠；pHS-2酸度計 上海雷磁儀器廠；TDL-5-A型離心機 上海分析儀器廠；KL-UP-III-10超純水制備機 臺灣艾柯實驗專業純水制備廠；HD-650桌上型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-150型恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；ZUV-2800 AH型紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；F600纖維測定儀、K9860全自動凱氏定氮儀濟南海能儀器公司；SXT-06索氏提取器 上海洪紀儀器設備有限公司；SPH620G紅外消解儀 濟南阿爾瓦儀器有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 粗壯脈紋孢菌孢子壁主要成分的測定

水分質量分數的測定采用GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》直接干燥法；粗纖維質量分數的測定采用GB/T 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》；粗脂肪質量分數的測定采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》索氏抽提法；蛋白質量分數的測定采用GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法。

幾丁質質量分數的測定采用考馬斯亮藍法[9]和凱氏定氮法。將干燥孢子壁樣品磨成粉末，取2 g樣品用體積分數96%乙醇溶液浸提至乙醇無色為止。用質量分數3% NaOH溶液于100 ℃水浴浸提多次，再用1 mol/L HCl溶液浸提多次。用質量分數2%的KMnO4溶液浸泡12 h，再以含1 mol/L NaHSO3的HCl溶液浸泡去色，最后水洗、干燥便成為粗純品。再在樣品中加入丙酮，混勻后加入12 mol/L HCl溶液，待溶解后將其清液加人至3 倍體積冷蒸餾水中。在4 ℃冰箱中放置過夜，4 200 r/min離心10 min，除去上清液，用水洗凈沉淀物至中性，干燥后即獲得純的蛋白質樣品。孢子壁的總氮質量分數（ω1/%）由全自動凱氏定氮儀測定；孢子壁的蛋白氮質量分數（ω2/%）由考馬斯亮藍法測定，孢子壁中的幾丁質質量分數根據式（1）計算。

式中：6.9為幾丁質中含氮質量分數的理論值。

1.3.2 粗壯脈紋孢菌孢子特性研究

1.3.2.1 差量法測孢子溶解性

準確稱取0.2 g（m1）經豆渣發酵72 h所得孢子，放置于玻璃試管中，分別用5 mL（V） 37 ℃水、60 ℃水、100 ℃水、1 mol/L HCl溶液、丙酮、無水乙醇溶解，漩渦振蕩2 min，抽濾，將固體不溶物質烘干至質量恒定（m2/g），根據式（2）計算孢子的溶解性。

1.3.2.2 孢子中總類胡蘿卜素的含量

采用酸熱法提取孢子中總類胡蘿卜素[10]，取0.25 g孢子于玻璃離心管中，加1 mol/L HCl溶液2 mL，混勻后浸泡3 min，抽濾至中性，加丙酮浸提30 min，4 200 r/min離心10 min后取上清液，重復提取一次，合并2 次的上清液于比色管中，稀釋至合適濃度，于461 nm波長處測吸光度。類胡蘿卜素含量按照公式（3）計算[11-12]。

式中：A為稀釋后丙酮提取液在461 nm波長處的吸光度；V為提取所用丙酮體積/mL；0.16是1 g類胡蘿卜素分子消光系數；m為所用干孢子的質量/g。

1.3.2.3 掃描電子顯微鏡觀察孢子形態及顆粒大小

將適量豆渣發酵72 h所得孢子置于培養皿中，采用掃描電子顯微鏡觀察孢子形態及大小[13]，鑒于孢子不導電，選用導電膠帶將其粘在掃描電子顯微鏡樣品臺上，用E-1010型離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍上一層1.5 nm厚的金屬銀膜。將處理好的樣品放入樣品盒中進行掃描觀察，同時拍照。

1.3.3 粗壯脈紋孢菌產類胡蘿卜素經體外消化性質變化

1.3.3.1 體外消化液的制備

模擬體外消化方法[14]如下：1）模擬口腔消化：取0.5 g粗壯脈紋孢菌孢子，加入5 mL模擬唾液消化液（simulated salivary fluid，SSF），漩渦振蕩5 min，使其充分溶解，再加3.5 mL SSF、0.5 mL α-淀粉酶、25 μL 0.3 mol/L CaCl2、975 μL蒸餾水、水浴37 ℃振蕩10 min。2）模擬胃消化：在10 mL上述口腔消化液中，加入7.5 mL模擬胃消化液（simulated gastric fluid，SGF）、1.6 mL 25 000 U/mL豬胃蛋白酶、5 mL 0.3 mol/L CaCl2溶液、0.2 mL 1 mol/L HCl溶液（pH 3）、0.695 mL水，37 ℃搖床120 r/min振蕩2 h。3）模擬小腸消化：在上述20 mL胃消化液中，加入11 mL模擬腸道消化液（simulated intestinal fluid，SIF）、5.0 mL 800 U/mL胰蛋白酶、2.5 mL 160 mmol/L新鮮膽汁、40 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液、0.15 mL 1 mol/L NaOH溶液、1.31 mL水，37 ℃搖床120 r/min振蕩2 h。

1.3.3.2 掃描電子顯微鏡觀察消化前后孢子形態

將消化液作用后的液體抽濾至中性，4 200 r/min離心10 min后取沉淀，并于60 ℃烘干成粉末狀，掃描電子顯微鏡觀察孢子形態，方法同1.3.2.3節。

1.3.3.3 粗壯脈紋孢菌孢子中類胡蘿卜素的釋放率

分別將經口、胃、小腸作用后的消化液進行抽濾，用丙酮進行沖洗，洗下孢子壁上的類胡蘿卜素，取抽濾瓶中的消化液轉移至圓底燒瓶，旋轉蒸發揮干液體，加入20 mL丙酮溶解粘在燒瓶壁上的類胡蘿卜素，重復加丙酮溶解提取一次，合并2 次的液體于比色管中定容，稀釋至合適濃度于461 nm波長處測吸光度。

類胡蘿卜素釋放含量按照1.3.2.2節公式（3）計算，計算出消化液中類胡蘿卜素含量與孢子中總類胡蘿卜素的含量，兩者進行比較得出消化過程中的類胡蘿卜素釋放率。

1.3.3.4 粗壯脈紋孢菌孢子中類胡蘿卜素體外消化前后抗氧化能力的測定

天然抗氧化物質的抗氧化能力測定有體外和體內兩種方式。體內實驗影響因素很多，研究比較困難，因而不適于快速的判斷物質的抗氧化能力[5]。體外抗氧化操作簡便而快速，可以實現快速高效的篩選以及檢測抗氧化物質的抗氧化特性[15]。參考文獻[16-17]，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、螯合金屬離子法對類胡蘿卜素抗氧化能力進行評價。

采用DPPH法[18]測定抗氧化能力：取10 mg DPPH用無水乙醇溶解于100 mL容量瓶中得到儲備液。取2.5 mL DPPH溶液（用無水乙醇配制，濃度為6.5×10－5mol/L），加入0.5 mL樣品溶液，搖勻后暗處放置，反應10 min后于517 nm波長處測定吸光度。以丙酮代替樣品溶液、無水乙醇代替DPPH溶液作為空白對照。DPPH自由基清除率根據式（4）計算。

式中：A0為對照實驗（樣品溶劑代替樣品）吸光度；A1為實驗吸光度；A2為樣品底色消除實驗（用無水乙醇代替DPPH溶液）吸光度。

采用螯合金屬離子法[19]測定抗氧化能力：取不同濃度的樣液1 mL，分別加入0.1 mL 2 mmol/L FeCl2和0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪，混勻后室溫靜置，反應10 min后于562 nm波長處測定吸光度。以樣品溶劑代替樣品溶液作為樣品空白，消除樣品底色，用無水乙醇代替菲啰嗪作為空白對照。金屬離子螯合率根據公式（5）計算。

式中：A1為樣品吸光度；A0為樣品干擾對照（用樣品溶劑代替樣液）吸光度；A2為空白對照（用無水乙醇代替菲啰嗪）吸光度。

1.3.4 貯藏條件對粗壯脈紋孢菌孢子中類胡蘿卜素的影響

將發酵培養得到的粗壯脈紋孢菌分為4 組，第1組置于25 ℃的恒溫培養箱保存，第2組置于4 ℃的冰箱冷藏室保存，第3組貯藏溫度為25 ℃錫箔紙避光保存，第4組貯藏溫度為25 ℃不避光保存。測貯藏過程中類胡蘿卜素含量變化及其抗氧化能力，方法分別同1.3.2.2、1.3.3.4節。

1.4 數據統計分析

用SPSS 20.0軟件對數據進行分析以及圖表繪制，檢測結果用平均值±標準差表示；所有實驗均重復3 次以上，并且用單因素方差分析比較平均值，P＜0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 粗壯脈紋孢菌孢子壁的主要成分

經測定，粗壯脈紋孢菌孢子壁中水分、粗纖維、粗脂肪、蛋白質和幾丁質質量分數分別為（17.70±0.63）%、（29.90±0.03）%、（0.32±0.11）%、（28.32±0.89）%和（0.66±0.13）%。在酵母菌中，細胞壁主要成分為β-葡聚糖、糖蛋白、幾丁質、水分和粗灰分，質量分數分別為39%、24%、30%、6%和1%[20-21]。可見，真菌類細菌的細胞壁和孢子壁組成相接近。

2.2 孢子特性研究

表1 粗壯脈紋孢菌孢子在不同溶劑中的溶解性Table 1 Solubility of Neurospora crassa spores in different solvents

由表2可知，孢子在水、丙酮溶液和乙醇溶液的溶解性均不理想，因此在開發粗壯脈紋孢菌孢子壁作為微膠囊壁材過程中，可能需要改良其壁材的成分和比例。

2.3 孢子中類總胡蘿卜素的含量

孢子中總類胡蘿卜素含量為（776.42±2.05）μg/g孢子。1954年，Zalokar[22]已經用實驗證明了粗壯脈紋胞菌類胡蘿卜素形成和其產量是由藍光來調節的。吳丹等[23]從江西傳統發酵食品中分離得到1株粗壯脈紋胞菌，后來，李紅艷等[24]發現其在有氧的條件下可以產生類胡蘿卜素，并發現在未優化的條件下粗壯脈紋胞菌類胡蘿卜素產量可達158.5 μg/g孢子。此后，劉志剛等[10]對此菌發酵稻谷加工副產物（礱糠和脫脂米糠）生產類胡蘿卜素的培養基進行了優化，優化后其類胡蘿卜產量可達366 μg/g培養物。類胡蘿卜素不是菌體自身生長發育所必需，它的產生是與粗壯脈紋孢菌適應外界環境緊密聯系的。與黑暗中生長的粗壯脈紋孢菌菌株相比，光照下粗壯脈紋孢菌菌株的al-3基因mRNA轉錄量提高了15 倍，光照下粗壯脈紋孢菌孢子中類胡蘿卜素含量比黑暗中生長的高[25-31]。Yoshida等[32]發現暴露在含氧空氣中可以引發粗壯脈紋孢菌中類胡蘿卜素的光誘導合成。本實驗選用自然光72 h培養，確保通風氧氣充足，從而提高了類胡蘿卜素含量（（776.42±2.05）μg/g孢子）。

2.4 孢子形態

圖1 粗壯脈紋孢菌孢子形態及顆粒大小Fig. 1 Scanning electron micrographs of Neurospora crassa spores

圖1 為掃描電子顯微鏡觀察粗壯脈紋孢菌孢子的形態及顆粒大小，可以看出，粗壯脈紋孢菌的分生孢子大多為卵圓形或球形，且成聚集狀態，粗壯脈紋孢菌孢子的顆粒直徑在4～20 μm間。

2.5 粗壯脈紋孢菌產類胡蘿卜素經體外消化性質變化

圖2 粗壯脈紋孢菌孢子經體外消化后的形態（×5 000）Fig. 2 Scanning electron micrographs of Neurospora crassa spores in simulated gastric fluid (× 5 000)

圖3 體外消化過程類胡蘿卜素釋放率Fig. 3 Release rates of carotenoids during in vitro digestion

由圖3可知，在體外消化過程中粗壯脈紋孢菌孢子中類胡蘿卜素的釋放率逐漸升高，口腔（9.35%）＜胃（18.78%）＜小腸（32.58%），經過體外消化后，共有32.58%的類胡蘿卜素從孢子壁中釋放出來。粗壯脈紋孢菌孢子經口腔消化液作用后有少量的類胡蘿卜素釋放，因為口腔條件作用較為溫和且作用時間較短，類胡蘿卜素不易被釋放。在胃消化液酸性條件下使孢子壁進一步破壁，更多的類胡蘿卜素被釋放，根據類胡蘿卜素的性質，類胡蘿卜素在酸性條件下不穩定、易分解[33-35]，有部分釋放出的類胡蘿卜素被胃酸作用分解，但總體上其含量仍然增加。孢子中類胡蘿卜素在小腸中釋放率達到最大值，其原因可能是孢子壁在小腸消化液中遇到胰酶后孢子壁上孔徑進一步增加，促進孢子匯總類胡蘿卜素的釋放。

圖4 類胡蘿卜素抗氧化活性Fig. 4 Antioxidant activity of carotenoids in digested spores

由圖4可知，粗壯脈紋孢菌經體外消化釋放在消化液中類胡蘿卜素的抗氧化活性呈持續上升趨勢，且和圖3體外消化過程類胡蘿卜素釋放率成正比。DPPH法測得消化液中類胡蘿卜素抗氧化活性，口腔（28.27%）＜胃（37.09%）＜小腸（56.08%）；螯合金屬離子法測得消化液中類胡蘿卜素抗氧化活性，口腔（21.40%）＜胃（28.74%）＜小腸（42.23%）。可見，消化液中類胡蘿卜素抗氧化活性顯著升高：口腔＜胃＜小腸，與孢子中類胡蘿卜素釋放率呈正相關，且胃和小腸消化液中類胡蘿卜素抗氧化活性與口腔消化液類胡蘿卜素抗氧化活性存在極顯著性差異（P＜0.01）。

2.6 貯藏條件對粗壯脈紋孢菌類胡蘿卜素的影響

圖5為貯藏過程中類胡蘿卜素含量變化，可以看出隨著貯藏時間的變化，粗壯脈紋孢菌中的類胡蘿卜素含量逐漸減少，呈下降趨勢，主要原因是在貯藏過程中類胡蘿卜素會逐漸分解。對比幾個貯藏條件下的粗壯脈紋孢菌中類胡蘿卜素的變化趨勢，可以發現在相同貯藏時間時類胡蘿卜素的含量：4 ℃黑暗組＞25 ℃黑暗組＞25 ℃光照組，貯藏9 d后類胡蘿卜素的減少率為：4 ℃黑暗組減少2.24%、25 ℃黑暗組減少3.19%、25 ℃光照組減少5.79%，比較可知，4 ℃黑暗條件下貯藏最利于保護粗壯脈紋孢菌中的類胡蘿卜素，類胡蘿卜素含量損失最少。光照加速類胡蘿卜素鏈的氧化和降解，導致類胡蘿卜素損失[36-37]。所以低溫黑暗條件有利于類胡蘿卜素的保存。

圖5 貯藏過程中類胡蘿卜素含量變化Fig. 5 Changes in carotenoid content during storage

圖6 貯藏過程中類胡蘿卜素抗氧化活性變化Fig. 6 Changes in antioxidant activity of carotenoids during storage

圖6 為貯藏過程中類胡蘿卜素抗氧化變化，可以看出，在貯藏過程中，粗壯脈紋孢菌中類胡蘿卜素的抗氧化活性均呈現下降的趨勢。由圖5可以看出隨著貯藏時間的變化，粗壯脈紋孢菌的類胡蘿卜素含量逐漸下降，故對比圖5、6可知，類胡蘿卜素含量與抗氧化活性呈正相關，貯藏過程中類胡蘿卜素含量的下降是造成其抗氧化活性下降的主要原因。對比3 個貯藏條件，黑暗組和4 ℃組之間的差異很小，光照組相比于這3 組抗氧化活性較低，貯藏9 d類胡蘿卜素的抗氧化活性下降率為：4 ℃黑暗組下降32.52%、25 ℃黑暗組36.95%、25 ℃光照組下降59.38%，故比較可得，4 ℃低溫貯藏和黑暗條件貯藏粗壯脈紋孢菌對其中類胡蘿卜素的抗氧化活性保護最好，光照條件貯藏粗壯脈紋孢菌不利于保護其中類胡蘿卜素的抗氧化活性，抗氧化活性下降最多。孫明奇等[38]的研究結果也表明，類胡蘿卜素對日光不穩定，光照對類胡蘿卜素有降解作用，主要是促使類胡蘿卜素分子中C＝C的氧化斷裂，使類胡蘿卜素發生異構化。所以進行類胡蘿卜素的相關研究以及后期的保藏過程中都要盡量避光保存。

3 結 論

本實驗測得粗壯脈紋孢菌孢子壁主要成分為水分、粗纖維、粗脂肪、蛋白質及幾丁質。經體外消化后，類胡蘿卜素的釋放率大小排序為小腸＞胃＞口腔，消化液中類胡蘿卜素抗氧化活性大小排序為小腸＞胃＞口腔。4 ℃低溫避光條件下貯藏最利于保護粗壯脈紋孢菌中的類胡蘿卜素，類胡蘿卜素含量損失最少，抗氧化活性下降最少。粗壯脈紋孢菌孢子壁在胃消化液酸性條件作用下可以很好地保護孢子中類胡蘿卜素的穩定性，在體外消化過程中釋放類胡蘿卜素32.58%，因此粗壯脈紋孢菌孢子壁是一個潛在的包埋不穩定營養素的壁材。