干燥方式對白三葉多糖理化性質和抗氧化活性的影響

李 然，段夢穎，尚紅梅*，楊君研

白三葉（Trifolium repens L.）別名白車軸草、荷蘭翹搖等，是豆科三葉草屬多年生草本植物，原產于歐洲和小亞細亞，16世紀在荷蘭首先栽培[1]。我國自20世紀20年代引種以來，全國各省區均有栽培。白三葉莖葉細軟、葉量豐富，粗蛋白含量高、纖維含量低，是一種優良牧草，可作為飼料或加工調制后利用。

多糖是一類由10 個以上單糖通過糖苷鍵連接所組成的高分子化合物，廣泛存在于微生物、植物和動物中[2]。多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等多種生物活性，被廣泛應用于食品業和醫藥業[3]。目前，糖生物學的時代正在加速到來，21世紀會是多糖生命科學蓬勃發展的黃金時期[4]。歐陽克蕙等[5]采取熱水浸提法提取白三葉草多糖并優化多糖提取條件，但目前尚鮮見關于白三葉多糖干燥方式的研究報道。干燥是多糖加工的重要工藝，對多糖的理化性質和生物活性有顯著影響[6]。本實驗通過研究干燥方式（熱風干燥、真空干燥和冷凍干燥）對白三葉多糖理化性質和抗氧化活性影響，以期找到一種有利于保持白三葉多糖抗氧化活性的干燥方法，為白三葉的加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白三葉開花期，取其地上部分，留茬5 cm，于吉林農業大學采收。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 東京化成工業株式會社；2,2’-聯氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2’-azino-bis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 北京博奧拓達科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HX-J漩渦混合器 常州朗越儀器制造有限公司；752紫外-可見分光光度計 上海現科分光儀器有限公司；101-2-BS電熱恒溫鼓風干燥箱、XMTD-204數顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械有限公司；SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；2XZ-2旋片式真空泵 臨海市譚氏真空設備有限公司；JJ-5控溫電動攪拌器 金壇市醫療儀器廠；DZF真空干燥箱 上海龍躍儀器設備有限公司；NDJ-8S黏度計 上海績泰電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白三葉多糖提取

將新鮮白三葉放入電熱恒溫鼓風干燥箱50 ℃下烘干，粉碎后過0.45 mm篩，得白三葉粉末。用體積分數95%乙醇溶液預處理（40 ℃）24 h，以除去單糖、色素和脂類等分子[7]，抽濾、干燥后得到多糖提取原料。稱取25 g預處理的白三葉粉末，加入500 mL去離子水提取白三葉多糖，浸提溫度90 ℃，浸提時間3 h。將提取液用6 層紗布過濾，收集濾液離心（3 000 r/min、10 min），合并上清液，60 ℃條件下減壓濃縮至原體積的1/4，加入3 倍體積無水乙醇醇沉12 h，離心（3 000 r/min、10 min），將沉淀用去離子水溶解，用Sevag試劑（V（氯仿）∶V（正丁醇）＝4∶1）除蛋白，透析（截留分子質量 1 400 Da，聯合碳化），得白三葉多糖。

1.3.2 白三葉多糖干燥

將白三葉多糖溶液平鋪于直徑為10 cm的玻璃培養皿中，厚度2 mm，采用3 種干燥方式（熱風干燥、冷凍干燥、真空干燥）進行干燥至恒質量。熱風干燥在電熱恒溫鼓風干燥箱（50 ℃）中干燥4.5 h；冷凍干燥時，先將多糖溶液在真空冷凍干燥機內預凍30～60 min，然后進行干燥，干燥時間7 h；真空冷凍干燥冷阱溫度為－66 ℃，真空度為0.19 Pa。真空干燥在真空干燥箱（50 ℃，0.09 MPa）中干燥3.5 h。干燥后按式（1）計算多糖得率。

1.3.3 多糖化學組成測定

總糖質量分數測定采用苯酚硫酸法[8]；可溶性蛋白質量分數測定采用考馬斯亮藍G250染色法[9]；氨基糖質量分數測定采用Elson-Morgan法[10]；糖醛酸質量分數測定采用硫酸-間羥聯苯法[11]；硫酸基質量分數測定采用氯化鋇-明膠比濁法[12]；水分質量分數的測定采用恒質量法[13]。各組分以占干質量的百分比計算。

1.3.4 pH值和相對黏度測定

配制2 mg/mL多糖水溶液（25 ℃），用pH計讀取5 min內的穩定數值，即為白三葉多糖的pH值[14]。配制10 mg/mL的白三葉多糖水溶液，在溫度為25 ℃下測定黏度，同時測定去離子水黏度，計算相對黏度[15]。

1.3.5 溶解度的測定

取0.1 g白三葉多糖置于150 mL燒杯中，加入50 mL的蒸餾水。然后在不同溫度（20、40、60、80 ℃和100 ℃）下水浴溶解，用磁力攪拌器攪拌（150 r/min），開始計時，直至完全溶解，記錄溶解消耗時間[6]。

1.3.6 紫外光譜特征

配制白三葉多糖溶液（1 mg/mL），以蒸餾水為空白，采用紫外-可見分光光度計在波長200～400 nm范圍內測定吸光度，每間隔10 nm測定1次，繪制白三葉多糖紫外光譜特征曲線，分析白三葉多糖中是否含有蛋白質和核酸[16]。

1.3.7 剛果紅實驗

稱取5 mg多糖樣品，加入2 mL蒸餾水和2 mL的剛果紅試劑（80 μg/mL），逐漸加入1 mol/L的NaOH溶液，使溶液中NaOH終濃度由0 mol/L逐漸升高到0.5 mol/L，并用紫外分光光度計進行掃描，測得各NaOH濃度條件下的最大吸收波長。不加多糖樣品，按相同方法測定各NaOH濃度條件下的最大吸收波長，作為空白對照。以NaOH濃度為橫坐標，最大吸收波長為縱坐標作圖。通過是否存在吸收峰判斷白三葉多糖糖鏈是否具有三股螺旋結構[17]。

1.3.8 不同干燥方式多糖抗氧化活性測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除活力測定

于1 mL 0.10 mmol/L DPPH溶液（用無水乙醇現用現配）中分別加入3 mL系列質量濃度（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600 mg/mL）的白三葉多糖溶液，混勻。室溫下在暗處反應30 min。用無水乙醇作空白調零，在517 nm波長處測定吸光度，以VC作陽性對照。以白三葉多糖濃度為橫坐標，DPPH自由基清除活力為縱坐標作圖[18]。DPPH自由基清除活力按式（2）進行計算。

式中：A0表示用蒸餾水代替多糖樣品按上述步驟測定的吸光度；A1表示按上述步驟測定多糖樣品的吸光度；A2表示用無水乙醇代替DPPH溶液按上述步驟測定的吸光度。

1.3.8.2 ABTS+·清除活力測定

ABTS工作液的配制：將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和1 mL 15 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下反應12 h，得到ABTS儲備液。使用時用蒸餾水稀釋成工作液，使其在室溫下、734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。

3 mL ABTS工作液與0.75 mL不同質量濃度（0.050、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250 mg/mL）的多糖溶液混合，室溫反應15 min。用蒸餾水作空白調0，在734 nm波長處測定吸光度，以VC作陽性對照。以白三葉多糖濃度為橫坐標，ABTS+·清除活力為縱坐標作圖[19]。ABTS+·清除活力按式（3）進行計算。

式中：A0表示用蒸餾水代替多糖樣品按上述步驟測定的吸光度；A1表示按上述步驟測定多糖樣品的吸光度；A2表示用蒸餾水代替ABTS溶液按上述步驟測定的吸光度。

1.3.8.3 還原力測定

于1.5 mL系列質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）多糖溶液中分別加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和1.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液，混合物在50 ℃條件下水浴20 min。冷卻后加入1.5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，混合，然后取該混合物1.5 mL，加入1.5 mL去離子水和0.3 mL 1 g/L氯化鐵溶液，室溫下反應10 min后，在700 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水為空白調零[20]。VC作陽性對照，按式（4）計算還原力。

式中：A1為按上述步驟測定多糖樣品的吸光度；A2為用蒸餾水代替氯化鐵溶液按上述步驟測定的吸光度。

1.4 數據統計與分析

多糖提取和干燥實驗設4 個重復（n＝4），計算多糖提取率，其他指標測定重復3 次（n＝3）。采用SPSS 22.0統計軟件進行數據方差分析，用Duncan法進行多重比較。多糖質量濃度對抗氧化活性指標的影響用Regression-Curve Estimation程序進行回歸分析。數據以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 干燥方式對白三葉多糖理化性質的影響

2.1.1 干燥方式對白三葉多糖化學成分的影響

不同干燥方式對白三葉多糖理化性質的影響見表1。冷凍干燥多糖的得率（10.92%）顯著高于熱風干燥（9.06%）和真空干燥（9.63%）（P＜0.05）。多糖的生物活性受其化學組成的影響[14]，因此有必要測定不同干燥方式所獲得白三葉多糖的化學組成。干燥方式對白三葉多糖蛋白質、氨基糖和水分質量分數無顯著影響（P＞0.05）。干燥方式對白三葉多糖的總糖質量分數、硫酸基質量分數和糖醛酸質量分數有顯著影響（P＜0.05），總糖和糖醛酸質量分數由高到低的干燥產品順序依次為：冷凍干燥＞真空干燥＞熱風干燥，可能原因是熱風干燥和真空干燥過程中較高溫度條件（50 ℃）導致糖醛酸等化學成分的變性，而冷凍干燥較低的溫度條件利于多糖活性成分的保存[21]。干燥方式對白三葉多糖pH值和相對黏度無顯著影響（P＞0.05）。由以上分析可知，冷凍干燥法是保存白三葉多糖中活性成分（如總糖、糖醛酸和硫酸基）的較有效手段。

表1 干燥方式對白三葉多糖化學組成、pH值和相對黏度的影響Table 1 Effects of drying methods on chemical composition, pH and relative viscosity of polysaccharides from Trifolium repens L.

2.1.2 干燥方式對白三葉多糖溶解度的影響

圖1 干燥方式對白三葉多糖溶解度的影響Fig. 1 Effects of drying methods on solubility of polysaccharides from Trifolium repens L.

由圖1可知，干燥方式對白三葉多糖溶解度有顯著影響（P＜0.05）。溶解時間隨著溫度的升高逐漸縮短。在20～100 ℃下，冷凍干燥多糖的溶解時間顯著短于熱風干燥多糖和真空干燥多糖（P＜0.05），可能原因是冷凍干燥多糖結構疏松，更容易溶解。

2.1.3 干燥方式對白三葉多糖紫外光譜的影響

圖2 干燥方式對白三葉多糖紫外光譜的影響Fig. 2 Effects of drying methods on UV spectrum of polysaccharides from Trifolium repens L.

由圖2可以看出，3 種干燥方式多糖的紫外光譜相似。在280 nm波長處的吸收峰歸因于蛋白質吸收，表明這3 種多糖含有少量的蛋白質或多肽。

2.1.4 白三葉多糖剛果紅實驗結果

圖3 不同NaOH濃度剛果紅-白三葉多糖絡合物紫外光譜最大吸收波長Fig. 3 UV spectrum maximum absorption wavelength of Congo red-polysaccharides from Trifolium repens L. at various NaOH concentrations

在堿性條件下，與剛果紅空白對照相比，具有三股螺旋結構的多糖與剛果紅形成的絡合物，溶液最大吸收波長會發生變化，而如果待測多糖不具有三股螺旋結構，其形成的絡合物將會與空白對照溶液最大吸收波變化趨勢相近[22]。如圖3所示，在NaOH濃度為0.0～0.1 mol/L時，3 種干燥方式所得多糖樣品的光吸收移向長波，表明樣品能與剛果紅形成絡合物，樣品有三股螺旋結構；NaOH濃度繼續增大時，最大吸收波長下降，表明多糖螺旋結構解體，變成無規則的線團形式，即樣品在弱堿性范圍內可形成有序的三股螺旋結構，在強堿性條件下，分子間氫鍵破壞，三股螺旋結構解體為單股，不能與剛果紅形成絡合物。在植物多糖中，具有三股螺旋型的多糖具有較高的生物活性。X射線衍射實驗表明，香菇多糖具有三股螺旋結構，并表現出抗癌活性；由于二甲基亞砜和尿素能夠改變香菇多糖的空間結構，在加入上述任意一種物質后香菇多糖空間結構發生改變，隨之香菇多糖的抗癌活性也消失[23]。

2.2 干燥方式對白三葉多糖抗氧化活性的影響

2.2.1 DPPH自由基清除活力

圖4 干燥方式對白三葉多糖DPPH自由基清除活力的影響Fig. 4 Effects of drying methods on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Trifolium repens L.

由于實驗操作的簡便性和穩定性，DPPH自由基清除活力被廣泛應用于測定樣品的抗氧化能力[17]。如圖4所示，Regression-Curve Estimation結果表明，隨著多糖質量濃度的增加，熱風干燥多糖（R2＝0.943，P＜0.05）、冷凍干燥多糖（R2＝0.897，P＜0.05）和真空干燥多糖（R2＝0.912，P＜0.05）的DPPH自由基清除活力均增加。冷凍干燥多糖的DPPH自由基清除活力顯著高于熱風干燥多糖和真空干燥多糖（P＜0.05），可能是不同干燥方式導致多糖有效成分（總糖、糖醛酸和硫酸基等）含量產生差異所致，據報道多糖的糖醛酸含量與其自由基清除活力顯著正相關[24]，而本實驗研究結果發現，冷凍干燥多糖的糖醛酸質量分數顯著高于熱風干燥多糖和真空干燥多糖（P＜0.05）；因此，冷凍干燥多糖的DPPH自由基清除活力較高。3 種干燥方式多糖的DPPH自由基清除活力均顯著低于VC（P＜0.05）。據報道，在多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，真空干燥、熱風干燥和冷凍干燥法獲得樺褐孔菌多糖的DPPH自由基清除活力大約為40%[25]，靈芝多糖的DPPH自由基清除活力范圍為20%～40%[26]。本實驗中，在多糖質量濃度為0.6 mg/mL時，白三葉多糖（冷凍干燥多糖）的DPPH自由基清除活力達到49.66%，說明白三葉多糖具有較強的DPPH自由基清除活力。

2.2.2 ABTS+·清除活力

圖5 干燥方式對白三葉多糖ABTS＋·清除活力的影響Fig. 5 Effects of drying methods on ABTS＋· activity of polysaccharides from Trifolium repens L.

ABTS+·清除活力測定方法操作簡單快速，被廣泛應用于樣品的抗氧化活性評估[19]。該方法是基于抗氧化劑可提供電子或氫原子滅活自由基，導致ABTS溶液顏色發生變化，再通過分光光度計進行測定的一種方法[27]。3 種干燥方式多糖的ABTS+·清除活力如圖5所示。Regression-Curve Estimation結果表明，隨著多糖質量濃度的增加，熱風干燥多糖（R2＝0.996，P＜0.05）、冷凍干燥多糖（R2＝0.981，P＜0.05）和真空干燥多糖（R2＝0.991，P＜0.05）的ABTS+·清除活力均與多糖質量濃度呈二次曲線關系。當質量濃度為0.050～0.750 mg/mL時，冷凍干燥多糖的ABTS+·清除活力顯著高于熱風干燥多糖和真空干燥多糖（P＜0.05），半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）由低到高的順序為：冷凍干燥多糖（0.203 mg/mL）＜真空干燥多糖（0.234 mg/mL）＜熱風干燥多糖（0.281 mg/mL）；說明冷凍干燥多糖的ABTS+·清除活力最高，熱風干燥多糖的ABTS+·清除活力最低。據報道，羥基在多糖ABTS+·的清除活力中起重要作用[14]；但是，在有氧條件下，羥基很容易發生氧化反應，熱風干燥過程中多糖暴露在有氧條件下，因此，熱風干燥多糖的ABTS+·清除活力較低。當質量濃度達到0.75 mg/mL后，3 種干燥方式所得多糖的ABTS+·清除活力達到VC水平；在質量濃度為1.25 mg/mL時，白三葉多糖（冷凍干燥多糖）的ABTS+·清除活力達到最大（99.74%）；據報道，亞側耳冷凍干燥多糖（4 mg/mL）的ABTS+·清除活力大約為30%[13]，蕪菁多糖（2 mg/mL）的ABTS+·清除活力大約為23%[28]，以上幾點說明白三葉多糖具有較強的ABTS+·清除活力。

2.2.3 還原力

圖6 干燥方式對白三葉多糖還原力的影響Fig. 6 Effects of drying methods on reducing power of polysaccharides from Trifolium repens L.

還原力是評價天然產物抗氧化能力的重要指標[20]。3 種干燥方式多糖的還原力如圖6所示，Regression-Curve Estimation結果表明，隨著多糖質量濃度的增加，熱風干燥多糖（R2＝0.987，P＜0.05）、冷凍干燥多糖（R2＝0.992，P＜0.05）、真空干燥多糖（R2＝0.988，P＜0.05）和VC（R2＝0.819，P＜0.05）的還原力均呈線性升高。在實驗質量濃度范圍（0.5～3.0 mg/mL）內，冷凍干燥多糖的還原力顯著高于熱風干燥多糖和真空干燥多糖（P＜0.05）。3 種干燥方式多糖的還原力均顯著低于VC（P＜0.05）。據報道，在多糖質量濃度為10 mg/mL時，大蒜[29]和亞側耳[14]多糖的還原力約為0.5。本實驗研究結果表明，在質量濃度為3 mg/mL時，白三葉冷凍干燥多糖的還原力達到1.36，說明白三葉多糖具有較強的還原力。

本實驗研究發現，白三葉多糖具有較強的還原力、DPPH自由基清除活力和ABTS+·清除活力。實際上，多糖發揮抗氧化作用的機制有多種。首先，多糖可能含有一些其他的抗氧化成分，比如肽類、黃酮、色素、多酚和蛋白質，這些成分可能對多糖的抗氧化活性有貢獻[30]：其次，多糖的金屬螯合能力與其抗氧化活性有關，而多糖分子結構中的硫酸基和糖醛酸是多糖發揮金屬螯合作用的基本要素[31]。白三葉冷凍干燥多糖的蛋白質、糖醛酸和硫酸基質量分數分別為1.97%、2.91%和0.97%，這些化學成分可能對白三葉多糖的抗氧化活性起到一定的作用。

3 結 論

本實驗研究了干燥方式（熱風干燥、冷凍干燥、真空干燥）對白三葉多糖得率、化學組成和抗氧化活性的影響，結果表明，干燥方式對白三葉多糖化學組成（總糖、糖醛酸和硫酸基質量分數）和溶解度等理化性質及抗氧化活性有顯著影響（P＜0.05）。與熱風干燥多糖和冷凍干燥多糖相比，冷凍干燥多糖具有更強的還原力、DPPH自由基清除活力和ABTS+·清除活力（P＜0.05）。因此，冷凍干燥法是制備白三葉多糖較好的干燥方式。