蒲公英萜醇對人乳腺癌細胞MCF-7增殖及凋亡的影響

朱 坤，丁米娜，楊 洋，車拴龍，陳麗艷,*

乳腺癌是全世界婦女中最常見的癌癥之一，也是女性癌癥死亡的主要原因[1]。在我國由于“西化的生活方式”和亂用外源性雌激素等原因，乳腺癌發病率有逐年增加的趨勢[2]。因此，探究乳腺癌發病機制，尋找新的乳腺癌治療藥物成為研究的熱點。近年來，從食品和中藥中提取的抗癌藥物因其副作用小、有效成分含量高而備受國內外研究者的關注。

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand. Mazz.）為菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum F.H.Wigg.）多年生草本植物[3]，在我國分布廣泛、產量高且價格低廉。蒲公英具有清熱解毒、消腫散結的功效，可全草入藥，是菜藥兼用佳品，不僅具有藥用價值，而且是一種營養價值很高的野生蔬菜，是開發綠色天然植物營養保健品的寶貴資源。蒲公英研究歷史已有數千年，在婦科中主要為治療乳癰腫痛良藥[4]。清代《本草正義》中有“蒲公英，其性清涼，治乳癰乳疔，紅腫堅塊，尤為捷效”的描述[5]。有研究發現噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）法檢測口服蒲公英提取液的大鼠尿液對人乳腺癌細胞MCF-7增殖具有抑制作用，并指出蒲公英萜醇、羽扇豆醇很有可能是此抑制作用的活性物質[6]。蒲公英萜醇屬于烏蘇烷型五環三萜類化合物，在蒲公英、杜香、檀香葉、紫菀等中藥中均有分布，其分子式是C30H50O，相對分子質量為426.729，可溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）[7-8]。近年研究表明蒲公英萜醇可以抑制胃癌、宮頸癌等腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡[9-10]，但其在抑制乳腺癌中的作用和機制尚不清楚。本實驗旨在研究蒲公英萜醇對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能的分子機制，為蒲公英萜醇的醫療開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳腺癌細胞系MCF-7為延邊大學腫瘤研究中心提供；蒲公英萜醇 西安昊軒生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、Hoechst 33342染料 美國Thermo公司；細胞培養皿、移液管、96 孔板 美國Corning公司；青霉素、鏈霉素 碧云天生物技術研究所；胰蛋白酶、MTT、DMSO 北京華美公司；熒光猝滅封固液 北京索萊寶科技有限公司；Western blot相關抗體 美國Cell Signaling公司；脫脂奶粉美國BD公司；Tris-HCl（1 mol/L，pH 8.8及pH 6.8）、質量分數30%丙烯酰胺 北京康為世紀生物科技有限公司；羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 美國Sigma公司；ECL試劑盒 美國Pierce公司。

1.2 儀器與設備

HERA-Cell 150 CO2培養箱 美國Thermo公司；DYCZ-40D型迷你轉印電泳儀 北京六一儀器廠；BX53倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite 200 PRO全波長多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 藥品配制

蒲公英萜醇用DMSO溶解，12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L蒲公英萜醇的培養基中DMSO質量分數分別為0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%，－20 ℃分裝保存，使用前解凍。

1.3.2 細胞培養

從液氮中取出凍存的人乳腺癌細胞株MCF-7并快速置于37 ℃水浴迅速使其融化，將細胞懸液轉移至離心管，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，使用含10% FBS及青霉素與鏈霉素各100 U/mL的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。每日倒置顯微鏡觀察細胞形態及生長情況，待細胞長至70%～80%時消化傳代。

1.3.3 MTT法細胞相對活力檢測

將對數生長期的細胞2×103個/孔接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養，待細胞貼壁后加入終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 和200.0 μmol/L蒲公英萜醇，每組設8 個平行復孔，對照組加入等體積的培養液。于24、48、72 h后每孔加入配制好的MTT溶液100 μL孵育4 h；去液體，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結晶物充分溶解，應用全波長多功能酶標儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度，并按下式計算細胞相對活力。

1.3.4 細胞集落形成測定（平板克隆實驗）

取對數生長期MCF-7細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，離心后把細胞重懸在10%胎牛血清的DMEM培養液中備用。將細胞懸液接種至6 孔板（500 個/孔），每孔0.2 mL培養液。置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后，加入50、100 μmol/L蒲公英萜醇處理細胞48 h，換為正常培養液繼續培養，兩周后出現鏡下可見的克隆，終止培養。棄去上清液，用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗兩次。加入1 mL甲醇固定30 min。棄去甲醇，加1 mL Gimsa染色液染色30 min，然后用自來水緩慢洗去染色液，室溫干燥。

1.3.5 Hoechst 33342熒光染色法檢測細胞凋亡

蓋玻片于無水乙醇中浸泡2 h以上并于紫外照射后，放入6 孔板中，將細胞接種于6 孔板，培養24 h。待細胞融合度達到60%時采用如1.3.4節藥物處理，其對照組用普通培養液繼續培養。24 h后棄去上清液，PBS清洗一次后加1 mL甲醇固定15 min，棄甲醇，PBS洗兩次，加入PBS配制的Hoechst 33342染色液0.5 mL，避光孵育30 min。去染色液，用PBS洗兩遍，吸盡液體滴一滴抗熒光猝滅封片劑于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，使細胞接觸封片劑，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.3.6 Western blot檢測

待細胞飽和度達到70%～80%，以預冷的PBS清洗3 次，加入RIPA裂解液提取總蛋白；Bradford法測定蛋白質量濃度；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉至聚偏二氟乙烯膜上；用TBST配制的質量分數5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入一抗后4 ℃過夜；次日室溫下TBST洗膜，加入相應二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯色、成像。β-actin蛋白作為內參，用Image J軟件對蛋白條帶進行掃描和定量分析，計算目標蛋白條帶灰度/內參條帶灰度的比值。

1.4 數據分析

所有實驗重復3 次以上，采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。實驗數據采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蒲公英萜醇抑制乳腺癌細胞的增殖作用

圖1 蒲公英萜醇對MCF-7細胞增殖的影響Fig. 1 Effect of taraxerol on the proliferation of MCF-7 human breast cancer cells

由圖1可知，用不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L）蒲公英萜醇處理MCF-7細胞，MTT實驗結果表明，24 h后的給藥組細胞增殖抑制效果不明顯；48 h后，給藥組細胞增殖受到明顯抑制，且隨著濃度增加，細胞增殖能力下降（P＜0.05）。提示蒲公英萜醇對乳腺癌細胞的抑制作用呈現良好的劑量-效應關系。

2.2 細胞克隆形成情況

圖2 平板克隆實驗檢測蒲公英萜醇對MCF-7細胞克隆形成的抑制作用Fig. 2 Taraxerol inhibited colony formation in MCF-7 human breast cancer cells as detected by the plate colony-forming assay

由圖2可知，平板克隆實驗結果顯示，MCF-7細胞經蒲公英萜醇（50.0、100.0 μmol/L）處理48 h并換為正常培養液培養兩周后，與對照組相比，克隆集落形成數量明顯減少；提示蒲公英萜醇可顯著抑制MCF-7細胞的增殖與克隆形成能力。

2.3 Hoechst 33342染色觀察細胞核微型態變化

圖3 Hoechst 33342染色檢測蒲公英萜醇誘導MCF-7細胞發生凋亡Fig. 3 Taraxerol exacerbated the apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells as evaluated by Hoechst 33342 staining

由圖3可知，經不同濃度（50.0、100.0 μmol/L）蒲公英萜醇處理48 h后，MCF-7細胞核形態發生改變，對照組細胞形態規則且呈均勻藍色熒光（圖中未顯示），染色質分散，細胞核呈橢圓形；藥物組細胞數量變少，呈致密濃染，顏色發白發亮，可見染色質凝集、核固縮或碎裂為小核，形成凋亡小體等典型的細胞凋亡形態學特征。蒲公英萜醇濃度愈高，細胞凋亡愈顯著。

2.4 Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達

圖4 蒲公英萜醇對MCF-7細胞的Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of taraxerol on the expression of Bcl-2 and Bax in MCF-7 human breast cancer cells

圖5 蒲公英萜醇對MCF-7細胞的Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和PARP蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of taraxerol on the expression of cleaved caspase-3,cleaved caspase-9 and PARP in MCF-7 human breast cancer cells

實驗結果表明，不同濃度（50.0、100.0 μmol/L）蒲公英萜醇處理48 h后Bax蛋白的表達顯著上調（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達極顯著下調（P＜0.01），因而Bax/Bcl-2表達極顯著增加（P＜0.01）（圖4）；同時，給藥組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的表達極顯著上調（P＜0.01），PARP表達極顯著下調（P＜0.01）（圖5）；提示蒲公英萜醇可通過線粒體途徑誘導MCF-7細胞發生凋亡。

3 討 論

蒲公英被譽為“天然抗生素”，具有營養保健作用，有著悠久的食用和藥用歷史。隨著對其開發利用價值的深入研究，其醫療保健功能逐漸受到重視。近年研究表明，蒲公英抗腫瘤的有效成分主要為多糖、三萜、黃酮、酚酸、植物甾醇等天然活性物質成分[11]。三萜類化合物是一類具有廣泛抗腫瘤等生物活性的化合物，在自然界中資源廣泛，對乳腺癌、直腸癌、肺癌等多種腫瘤均具有顯著的抑制效果。蒲公英萜醇屬五環三萜類化合物，本實驗發現，蒲公英萜醇可抑制人乳腺癌細胞MCF-7的增殖，并通過線粒體途徑誘導凋亡的方式發揮其抗腫瘤作用[12-14]。

MTT比色法是檢測活細胞數量的常用方法[15]，在代謝過程中，活細胞線粒體與NADP相關的脫氫酶可以將黃色的MTT還原為藍色甲瓚結晶，通過酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度，從而檢測出細胞的存活率[16-17]。本實驗通過不同濃度的蒲公英萜醇處理人乳腺癌細胞MCF-7 24、48、72 h后，發現48、72 h產生明顯抑制細胞增殖的作用，且該抑制作用呈濃度依賴性。細胞在體外培養的過程中，單個細胞分裂繁殖6 代以上的后代組成的細胞群體，稱為集落或克隆。集落形成率表示細胞獨立生存能力。因此，本實驗采用平板克隆實驗進一步檢測蒲公英萜醇對MCF-7細胞生長抑制的影響，結果顯示蒲公英萜醇能有效抑制乳腺癌細胞增殖和集落形成。

細胞凋亡是由基因控制的細胞在生理病理狀態下發生的一種自發性、程序性死亡[18]，它與癌癥等許多疾病的發生發展有關，且誘導腫瘤細胞發生凋亡是許多抗癌藥物作用的主要機制之一。細胞凋亡首先表現為形態學改變，因此細胞形態學觀察成為判斷細胞凋亡最基本和可靠的方法。Hoechst染色是一種經典而又快速的細胞凋亡形態學檢測方法[19]。當細胞發生凋亡時，與鄰周細胞脫離，胞漿聚縮，核染色體密度增加，呈半月形，且在核膜周邊凝集，核仁發生裂解，細胞內陷，進而形成凋亡小體。本實驗通過熒光顯微鏡觀察結果，從形態學上證實蒲公英萜醇能夠誘發MCF-7細胞凋亡，細胞核出現明顯的凋亡形態學特征，且呈劑量依賴性。

有研究發現蒲公英萜醇主要通過線粒體途徑誘導HeLa細胞凋亡，且可以誘導抗凋亡蛋白Bcl-2的下調和促凋亡蛋白Bax的上調[20]。Bcl-2家族是一類與凋亡密切相關的調節基因，研究表明，Bcl-2和Bax蛋白水平高低與凋亡調控直接相關，Bax與Bcl-2的比值可以決定細胞在受凋亡刺激后的生存能力[21-24]。在細胞凋亡的過程中，Caspase-3和Caspase-9常被作為細胞線粒體凋亡途徑的早期檢測指標，而PARP是一種DNA修復酶和最具特征性的蛋白酶解底物，當細胞損傷過度時，細胞凋亡啟動使PARP發生水解[25-26]。為了進一步闡明蒲公英萜醇誘導乳腺癌發生凋亡的機制，本實驗研究了凋亡相關蛋白的表達。實驗結果表明，蒲公英萜醇給藥組可明顯上調Bax/Bcl-2比值，同時誘導Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達上調，PARP表達下調，表明蒲公英萜醇可活化Bcl-2和Bax，激活Caspase-3和Caspase-9，被激活的Caspase-3將PARP裂解，促進DNA斷裂，誘導細胞凋亡[27-28]。以上結果提示蒲公英萜醇可通過線粒體途徑誘導乳腺癌細胞凋亡。

綜上所述，蒲公英萜醇對人乳腺癌細胞MCF-7增殖具有良好的抑制作用，并可通過線粒體途徑誘導乳腺癌細胞凋亡，但對其抗腫瘤作用潛在的多種分子機制還需要進一步深入研究。