大豆蛋白與大豆低聚肽對負氮平衡老年小鼠表皮創傷感染下的免疫調節作用

張 健，李雯暉，趙博雅，李 赫，劉新旗,*，肖 林

大豆蛋白主要由大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白組成，其氨基酸構成相對平衡。大豆低聚肽是指大豆分離蛋白經蛋白酶作用或微生物技術處理后，再經過分離和精制等工藝處理得到的低聚肽混合物，通常含有3～6 個氨基酸，分子質量低于1 000 Da，其中還包括少量游離氨基酸、糖類、水分和灰分等[1-2]。大豆低聚肽的氨基酸組成與大豆蛋白基本相同，具有良好的必需氨基酸平衡性，其氨基酸吸收、轉運速度均高于含等量氨基酸的蛋白質和游離氨基酸[3-6]。大豆低聚肽具有調節免疫功能、降血壓、降低膽固醇、改善脂質代謝、抗疲勞等功能特性[7-10]，是目前大豆蛋白研究中的一個熱點。

我國已經步入老齡化社會，隨著年齡增長，人體的基礎代謝和消化能力下降，特別是蛋白酶活力下降尤為明顯，蛋白質的消化吸收減少引起老年人體內“負氮平衡”[11-12]，最終導致免疫力下降、肌肉萎縮、睡眠障礙等各種老年人常見的健康問題。營養支持不僅為人體提供熱量、蛋白質等營養物質，還直接參與機體代謝，是人體免疫功能的物質基礎[13-14]。免疫營養不僅能防止營養缺乏，且能通過特定方式刺激免疫細胞，增強機體免疫應答，通過調控細胞因子的產生和釋放減輕過度的炎癥反應[15]。

大豆蛋白與大豆低聚肽作為重要的營養物質影響著動物的免疫功能，是維持和調控動物免疫功能的直接參與者。與大豆蛋白相比，大豆低聚肽因為其吸收快、利用率高、氨基酸平衡好等特點，可更好地發揮免疫營養支持作用，更適合解決老年人負氮平衡以及由此引發的健康問題。目前很少有大豆蛋白與大豆低聚肽對負氮平衡狀況下體內免疫功能調節的報道，本實驗通過研究大豆蛋白與大豆低聚肽對負氮平衡老年小鼠在金黃色葡萄球菌感染情況下免疫功能的調節作用，分析小鼠體液免疫、血清炎癥因子、趨化因子的變化，以及大豆蛋白與大豆低聚肽的作用差異，旨在探索改善負氮平衡下免疫應答的營養干預方法。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性ICR小鼠（48 只，8 月齡，體質量40～50 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001；低蛋白飼料（蛋白質量分數1.5%）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0008；金黃色葡萄球菌金黃亞種（編號1.801）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

大豆蛋白 山東御馨生物科技有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；Gel Filtration Calibration kit 美國GE公司；小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M、IgG、IgA試劑盒 北京方程佰金科技有限公司；小鼠白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、巨噬細胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）、正常T細胞表達與分泌調節活化因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）luminex試劑盒美國默克公司。

1.2 儀器與設備

EX623ZH千分之一天平、NVL5100B電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；0.2 μm陶瓷微濾膜、超濾膜（截留相對分子質量2×103） 江蘇久吾高科技股份有限公司；LRH-250F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-75SII高壓滅菌器、SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博迅實業有限公司；X-30R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；AKTA Pure蛋白質層析純化系統 美國GE公司；BIO-PLEX3D新型液相芯片檢測儀北京雅聯百得科貿有限公司；Infinite 200 Pro Nanoquant酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆低聚肽的制備

將大豆蛋白溶于蒸餾水中，使其充分溶解，配制成質量分數8%的蛋白溶液，調pH值至7.0，各加入質量分數0.1%的1 000 U/g中性蛋白酶和堿性蛋白酶，50 ℃水浴，水解4 h。水解結束后立即85 ℃滅活15 min，得到低聚肽酶解液。冷卻后40 ℃、0.6 bar通過復合膜（陶瓷微濾膜與超濾膜）過濾提純[16]，得到大豆低聚肽及膜分離副產物。通過0.12 mbar、－42 ℃真空冷凍干燥30 h得到凍干大豆低聚肽粉末。

1.3.2 大豆蛋白及大豆低聚肽的SDS-PAGE分析

質量分數12%分離膠、質量分數5%濃縮膠，樣品質量濃度約1 μg/μL，上樣量10 μL/孔，電壓80 V條件下進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以三色預染蛋白（分子質量為10～180 kDa）為標準蛋白。電泳結束后，經考馬斯亮藍染色、脫色后分析。

1.3.3 大豆低聚肽的分子質量分布

取大豆低聚肽凍干粉制成大豆肽溶液，過0.22 μm微濾膜。在蛋白質層析純化系統中過Superdex peptide 10/300GL柱，用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液，控制恒定流速0.5 mL/min，220 nm波長處檢測。

1.3.4 負氮平衡老年小鼠模型制備

選取8 月齡清潔級雄性ICR小鼠，單籠飼養，適應性飼養一周后，分成普通飼料組（12 只）與低蛋白飼料組（36 只）。普通飼料組飼喂蛋白質量分數為20%的普通飼料，低蛋白飼料組飼喂蛋白質量分數為1.5%的低蛋白飼料，自由采食飲水，飼喂2 周，構建負氮平衡老年小鼠模型。每3 d記錄體質量一次，在飼喂2 周后，每組各取5 只小鼠放入代謝籠中飼養，收集小鼠24 h的糞便和尿液樣品，同時記錄攝食量，測定糞便和尿液中氮的質量以及氮攝入量，同時對小鼠進行尾尖采血，收集血清樣本，測定血清中血清總蛋白（total protein，TP）與血清白蛋白（serum albumin，ALB）的質量濃度。分別按式（1）、（2）計算每只小鼠的氮平衡量和蛋白質表觀消化率[17-18]。

1.3.5 金黃色葡萄球菌培養

將金黃色葡萄球菌劃線接種于營養瓊脂培養基上，37 ℃培養過夜，挑取單個菌落，接種至新鮮營養肉湯中，37 ℃恒溫搖床100 r/min培養20 h后，平板計數法計算菌液濃度，用營養肉湯系列稀釋至菌液濃度約1×108CFU/mL，離心收集菌體，以生理鹽水洗滌懸浮，備用[19]。

1.3.6 小鼠的分組及處理

將48 只小鼠分為4 組，每組12 只，單籠飼養，自由采食飲水，室溫保持（25±1）℃。分別為空白組（飼喂普通飼料的正氮平衡小鼠，灌胃生理鹽水）、模型組（飼喂低蛋白飼料的負氮平衡小鼠，灌胃生理鹽水）、蛋白組（飼喂低蛋白飼料的負氮平衡小鼠，灌胃大豆蛋白）、低聚肽組（飼喂低蛋白飼料的負氮平衡小鼠，灌胃大豆低聚肽），各組灌胃量為0.4 mL，蛋白組與低聚肽組灌胃液體總含氮量相等，以體質量計為650 mg/kg。

將所有小鼠以1%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）麻醉后，于小鼠背部手術區剪毛，在小鼠背部脊柱兩側，切除1 cm×1 cm的全層皮膚及皮下組織，破壞肌膜，取金黃色葡萄球菌菌液0.1 mL，均勻涂抹于整個創面，觀察小鼠創面感染情況[19]。創傷涂抹金黃色葡萄球菌后每日對小鼠灌胃，每組于連續灌胃第3天與第7天分別處死6 只小鼠。

1.3.7 小鼠的處死及血清的制備

于灌胃的第3天和第7天小鼠眼球取血后處死，血液置于4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，分離上清液得到血清收集于滅菌離心管中，于－70 ℃保存。

1.3.8 小鼠血清免疫因子的測定

取保存的血清，以酶聯免疫吸附測定法測定負氮平衡老年小鼠血清IgM、IgG、IgA質量濃度，按照luminex試劑盒要求以流式熒光技術測定免疫炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及趨化因子（MIP-2、RANTES）質量濃度。

1.3.9 小鼠股直肌濕質量與體質量比的測定

剝離小鼠右腿股直肌肌肉組織，稱其濕質量，按式（3）計算股直肌濕質量與體質量比。

1.4 數據處理

所有數據均以 ±s表示。采用SPSS Statistics 22軟件進行統計分析。多組均數進行方差齊性檢驗和單因素方差分析（ANOVA）和多重比較（Duncan’s法），P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 大豆低聚肽的SDS-PAGE分析

圖1 大豆蛋白與大豆低聚肽的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE pattern of soybean protein and soybean oligopeptides

由圖1可知，大豆蛋白經復合酶水解后，酶解產物分子質量遠低于大豆蛋白，酶解產物中主要肽段分子質量低于10 kDa，表明大豆蛋白大部分已被酶解為小分子低聚肽。本實驗選用Marker分子質量范圍是10～180 kDa，同時SDS-PAGE凝膠電泳不容易分離分子質量在4 kDa以下的小肽，所以酶解液中低于10 kDa的肽段沒有得到明顯的分離。酶解產物經過復合膜組合的方式進行分離提純，減少大分子肽和未酶解蛋白的混入，得到純度更高的低聚肽。

表1 大豆低聚肽的分子質量分布Table 1 Molecular mass distribution of soybean oligopeptides

由表1可知，經過蛋白層析純化系統分析，有85.59%大豆低聚肽分子質量分布在150～1 000 Da之間。

2.2 負氮平衡制備期老年小鼠體質量的變化

圖2 負氮平衡制備期小鼠體質量的變化Fig. 2 Change in body mass of mice during negative nitrogen balance

小鼠體質量的下降是負氮平衡的重要生理指標之一。實驗期間，兩組小鼠的飼料攝入總量無顯著差異（P＞0.05），由圖2可知，低蛋白飼料組小鼠的體質量明顯下降，從第7天開始，低蛋白飼料組小鼠體質量顯著低于普通飼料組，且隨時間延長差異逐漸增大。實驗結果表明，低蛋白飼料飼喂小鼠可影響其正常的生長發育，造成體質量降低。研究發現，給大鼠飼喂低蛋白飼料，會使低蛋白組大鼠體質量顯著低于正常飼料組[20-21]。

2.3 負氮平衡制備期小鼠氮代謝相關指標的測定結果

機體攝入食物中的含氮營養物質經消化、吸收與代謝，一部分沉積在體內或被利用，合成機體內的蛋白物質，另一部分代謝為廢物隨尿等排出，構成機體的氮代謝[22]。氮平衡是評估蛋白質代謝狀況最常用和最有效的指標[23]。

表2 第14天小鼠氮代謝相關指標的變化Table 2 Changes in nitrogen metabolism indexes of mice on day 14

由表2可知，在負氮平衡制備期第14天，普通飼料組小鼠氮代謝呈正氮平衡，而低蛋白飼料組呈負氮平衡。普通飼料組小鼠蛋白質表觀消化率為（81.31±7.00）%，低蛋白飼料組小鼠蛋白質表觀消化率為（54.35±4.35）%。兩組小鼠氮平衡與蛋白質表觀消化率均有顯著性差異（P＜0.05）。低蛋白飼料組小鼠氮排泄量多于氮攝入量，表明體蛋白合成率相對減少或降解率相對增加，體內營養物質、肌肉被過度消耗，造成體內氮平衡處于負值，并造成體質量降低。由于低蛋白飼料組小鼠氮攝入量很少，使得無氮膳食期的糞代謝氮對表觀消化率的影響變大，故低蛋白飼料組的蛋白質表觀消化率顯著降低。

2.4 負氮平衡制備期小鼠血清蛋白質量濃度的測定結果

TP反映機體的蛋白質營養狀況及肝臟合成功能等情況。ALB是TP的主要蛋白質成分，由肝臟合成。TP、ALB可代表體內蛋白質代謝及營養狀況[24]。ALB半衰期長，約20 d，且其影響因素較多，可能對蛋白質代謝和營養狀況的短期變化不敏感[25]。

表3 第14天小鼠血清蛋白質量濃度的變化Table 3 Change in serum proteins of mice on day 14

由表3可知，在負氮平衡制備期第14天，低蛋白飼料組小鼠TP顯著低于普通飼料組（P＜0.05），且其ALB質量濃度低于普通飼料組但差異不顯著（P＞0.05）。實驗結果表明低蛋白飼料飼養的小鼠體內氮代謝發生改變，由于含氮營養物質攝入不足，導致蛋白質合成率降低，使體內TP質量濃度降低。本研究通過對老年小鼠飼喂低蛋白飼料制備負氮平衡老年小鼠模型，通過2 周低蛋白飼料飼養，對兩組小鼠的體質量、體內氮代謝及血清蛋白質量濃度進行分析，可判斷負氮平衡老年小鼠模型建立成功。

2.5 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠血清免疫球蛋白的影響

血清免疫球蛋白在體液免疫中發揮重要作用，是介導體液免疫的主要抗體，在一定程度上反映了體液免疫水平[26]。IgM約占抗體總量的5%～10%，因其分子質量極大，故僅限在血管內運行，是初次體液免疫應答早期階段產生的主要抗體，具有較強的抗感染作用。IgG是機體再次體液免疫應答產生的主要抗體，是血液中含量最高的一種抗體，在機體防御機制中發揮抗感染作用，約占抗體總量的80%～85%。IgA的含量僅次于IgG，約占抗體總量的10%，是少數在消化道中不被消化的蛋白質之一。IgA在保護腸道、呼吸道、泌尿生殖道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起關鍵作用，能凝集顆粒性抗原和中和病毒[27]。

表4 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠血清免疫球蛋白的影響（n=6）Table 4 Effect of soybean protein and soybean oligopeptides on serum Ig levels in mice (n= 6)

通常IgM、IgG、IgA這3 類免疫球蛋白水平就可以代表血清免疫球蛋白的總體水平[28]。由表4可知，蛋白組、低聚肽組與模型組相比較，可顯著提高IgM與IgG的質量濃度（P＜0.05）；蛋白組、低聚肽組與空白組相比較，可顯著提高IgG的質量濃度（P＜0.05），說明大豆蛋白和大豆低聚肽的蛋白營養補充支持作用可顯著提高負氮平衡老年小鼠感染后體液免疫功能。在感染第7天，低聚肽組IgG水平顯著高于蛋白組（P＜0.05），低聚肽組IgM與IgA水平高于蛋白組但差異不顯著（P＞0.05），說明大豆低聚肽的營養補充作用對負氮平衡老年小鼠感染后體液免疫的提高優于大豆蛋白。張為鵬等[29]在豬飼料中分別補充血漿蛋白粉和植物活性肽，顯著提高了血清中IgG抗體的水平（P＜0.05）。B細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞，合成和分泌免疫球蛋白，血清免疫球蛋白的變化能及時反應B細胞的數量及活性。楊小軍[30]在實驗中對大鼠灌胃植物源面筋蛋白酶解活性肽，提高了大鼠IgA的水平，顯著提高了血凝抑制效價，促進了大鼠的體液免疫，推測肽作為B細胞刺激因子或活化輔助受體而起作用。B細胞表面有很多受體，肽可能刺激B細胞，發生增殖、分化，進入激活狀態，轉化為漿細胞，產生抗體[31]。本研究中大豆蛋白與大豆低聚肽也可能通過作用于B細胞膜表面受體，調節細胞活性，從而提高小鼠體液免疫水平。

2.6 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠血清炎癥因子的影響

微生物感染的炎癥反應的一個主要特征就是細胞因子的釋放，這些因子在宿主對抗感染和炎癥的免疫應答中起著重要的作用。在炎癥反應過程中，IL-1β、IL-6和TNF-α的水平會迅速增加[32]。IL-1β、IL-6和TNF-α的表達對免疫系統是必不可少的，但是過多的分泌會導致全身的炎癥[33]。

IL-1β對宿主免疫系統抵抗金黃色葡萄球菌感染時有顯著的調節作用。IL-6在感染過程中是一種重要的促炎細胞因子，它與炎癥反應中的多種生物效應有關。TNF-α被認為是炎癥指標中的一個主要細胞因子[34]。

表5 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠血清炎癥因子的影響Table 5 Effect of soybean protein and soybean oligopeptides on serum inflammation factors in mice

由表5可知，模型組與空白組比較，IL-1β、IL-6和TNF-α 3 種炎癥因子質量濃度有不同程度的升高，但差異不顯著（P＞0.05），說明模型組小鼠炎癥水平有一定升高；蛋白組、低聚肽組與模型組相比較，3 種炎癥因子質量濃度有所降低，但是差異不顯著（P＞0.05），IL-6質量濃度降低最為顯著，接近空白組質量濃度。對胃癌術后患者進行腸內免疫營養干預，可有效降低炎癥指標（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平[35]。對脂代謝紊亂大鼠給予含大豆蛋白飼料，顯著降低了大鼠血清IL-6與TNF-α質量濃度[36]。實驗結果表明灌胃大豆蛋白與大豆低聚肽對炎癥水平的抑制有積極作用，對IL-6的抑制作用較為強烈。

2.7 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠血清趨化因子的影響

MIP-2是炎癥早期的促炎性細胞因子，其在炎癥早期的短期急劇釋放可能趨化和激活多種炎癥細胞，當機體局部有炎癥時能夠趨化單核細胞向炎癥部位聚集[37]。RANTES具有遷移細胞的作用，對活化T淋巴細胞、粒細胞、單核細胞、自然殺傷細胞具有趨化和刺激作用，誘導其向炎癥部位浸潤，發揮殺傷作用[38]。

表6 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠血清趨化因子的影響Table 6 Effect of soybean protein and soybean oligopeptides on serum chemokines in mice

由表6可知，與空白組比較，低聚肽組MIP-2質量濃度顯著降低31.7%（P＜0.05），而蛋白組降低水平不顯著，說明大豆低聚肽較大豆蛋白吸收轉化速率快，可對炎癥早期起作用的MIP-2起到良好的抑制作用；蛋白組、低聚肽組與空白組、模型組相比，可顯著降低RANTES水平（P＜0.05），說明大豆蛋白與大豆低聚肽的營養補充支持作用可有效抑制炎癥趨化因子的生成，降低炎癥水平。蔣莉婭等[39]發現大鼠降低MIP-2以及MIP-2 mRNA生成水平，可緩解機體炎癥，保護大鼠急性胰腺炎早期肺損傷。本實驗結果表明大豆蛋白與大豆低聚肽的營養補充作用可顯著抑制MIP-2與RANTES的質量濃度，防止過度的分泌造成組織損傷與過度炎癥，大豆低聚肽由于吸收速度快，轉運耗能少，其營養補充可在炎癥早期有效抑制過度的炎癥反應。

2.8 大豆蛋白與大豆低聚肽對小鼠股直肌質量的影響

圖3 小鼠股直肌濕質量與體質量比Fig. 3 Ratio of rectus femoris and body mass in mice

由圖3可知，蛋白組、低聚肽組小鼠的股直肌濕質量與體質量比均高于模型組與空白組；在感染第3天，蛋白組、低聚肽組股直肌濕質量與體質量比均顯著高于模型組（P＜0.05），蛋白組與低聚肽組無顯著差異（P＞0.05）；在感染第7天，低聚肽組股直肌濕質量與體質量比為3.93，顯著高于蛋白組（2.91）（P＜0.05）。實驗結果表明大豆蛋白與大豆低聚肽的營養補充，可顯著提高股直肌濕質量與體質量比，改善老年小鼠因負氮平衡引起的肌肉萎縮狀況，大豆低聚肽由于吸收速度快，利用率高，作用優于大豆蛋白。負氮平衡和炎癥情況會使骨骼肌中蛋白質降解增加，氨基酸進入血漿中合成免疫細胞因子，參與免疫系統的調節，機體將本用于生長和骨骼肌沉積的營養物質用于維持體內激活的免疫系統，導致骨骼肌分解加速，蛋白質合成速度減慢[40]。與大豆蛋白相比，大豆低聚肽因為在腸黏膜上的轉運載體不易飽和，轉運能耗低，轉運速度快[41]，可增強機體氨基酸吸收代謝，使體蛋白分解代謝減少，增加體氮沉積，緩解肌肉萎縮狀況。

3 結 論

本研究采用低蛋白飼料飼喂小鼠從而引起小鼠體內負氮平衡狀態，通過小鼠體質量、體內氮平衡、血清蛋白等結果驗證負氮平衡老年小鼠模型造模成功。對負氮平衡老年小鼠進行背部創傷感染金黃色葡萄球菌，通過灌胃大豆蛋白與大豆低聚肽，顯著提高了小鼠血清IgM、IgG、IgA質量濃度，降低了血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質量濃度，降低了血清RANTES、MIP-2質量濃度，顯著提高了股直肌質量，表明大豆蛋白與大豆低聚肽能提高金黃色葡萄球菌感染下負氮平衡老年小鼠體液免疫水平，降低其炎癥水平，緩解并恢復肌肉萎縮狀況，大豆低聚肽較大豆蛋白能更有效地提高體液免疫水平，并在炎癥早期顯著抑制炎癥反應，提高短期應激能力。