氨基甲酸乙酯誘導HepG2細胞凋亡的分子機制

劉會昌，石建新*

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）又名脲烷，是工業生產的重要原料，廣泛用于生產農藥、熏蒸劑和化妝品，也曾作為安眠和抗腫瘤藥物及止疼藥助溶劑供人們使用。值得注意的是，EC是食品加工過程中的一種副產物，廣泛存在于發酵食品中，如白蘭地、黃酒、葡萄酒、面包、醬油和酸奶等，也存在于香煙和空氣污染物中[1]。動物實驗結果表明，EC具有遺傳毒性、致癌性和免疫毒性，可誘導小鼠、大鼠等嚙齒類動物和猴子等靈長類動物的腫瘤發生[2-4]。因此，EC很可能對人類也有一定的致癌風險。國際癌癥研究機構已于2007年將其列為很可能致癌物（2A類）[5]。

之前的EC毒性機制研究大都是在動物中開展的，其結果并不能真實反映EC對人體的毒性作用。出于動物福利的考慮，人體組織細胞體外培養技術越來越多用于EC對人類細胞的毒性研究。目前認為，EC對人體細胞的毒性主要表現有降低細胞活性、抑制細胞增殖、引起細胞內氧化應激反應、擾亂細胞周期、誘導線粒體代謝紊亂和細胞凋亡[6-9]。細胞毒性實驗結果表明，EC促進細胞內活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）積累，對細胞內生物大分子（蛋白質、脂類和核酸等）造成損傷，影響細胞代謝活動[10]。EC能激活細胞P53代謝通路，激活P21蛋白，抑制細胞周期蛋白E和Cdk2蛋白的表達，從而阻礙細胞從G1期向S期轉換，G0期細胞數目增多，細胞由分裂狀態轉向靜息狀態，從而影響細胞周期[7]。前期工作發現，HepG2細胞可以吸收EC并在體內積累，從而導致細胞凋亡，但EC的毒性機制并未闡明[6]。本研究在前期研究的基礎上，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和蛋白免疫印跡技術檢測EC（100 mmol/L）處理對HepG2細胞凋亡通路基因的影響，進一步揭示EC對人體細胞的毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細胞（人體肝癌細胞株），購買自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

表1 細胞凋亡相關基因及其RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences for tested apoptosis-related genes

氨基甲酸乙酯 美國Sigma公司；胎牛血清 法國Biowest公司；胰酶 上海安普科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液 北京索萊寶生物科技公司；TRIzol Reagent 美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；Supereal PreMix Plus（SYBR Green）天根生化科技有限公司；NP-40和BCA蛋白質量濃度測定試劑盒 中國碧云天生物技術公司；Noxa抗體、IP3R抗體、TNFRSF10D（DcR2）抗體 英國Abcam公司；IRE1α抗體、Caspase-9抗體、APAF1抗體、Bim抗體、β-Actin抗體 美國Cell Signaling Technology公司；乙醇、氯仿、異丙醇（均為分析級） 上海國藥集團有限公司；引物由美國Life Technology公司合成（表1）。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇州施威克環?？萍加邢薰荆幻笜藘x、高速離心機 基因有限公司；CO2恒溫培養箱 上海三騰儀器有限公司；LightCycler?480 qPCR儀 瑞士羅氏公司；電泳儀及轉膜儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與EC處理

采用完全DMEM培養基（含10%胎牛血清和1% 100×青霉素-鏈霉素溶液）培養HepG2細胞，恒溫培養箱條件設置為37 ℃、5% CO2。細胞每周傳代2～3 次。細胞培養至對數生長期進行藥物處理。將EC溶解在完全培養基（含FBS和雙抗的DMEM培養基）中，EC終濃度為100 mmol/L。對照組是不加EC的完全培養基。根據之前研究結果，藥物處理時間分別設置為4 h和12 h。對照組和實驗組均包含3 個生物學重復，每個生物學重復含3 個培養孔。

1.3.2 qPCR檢測細胞凋亡相關基因mRNA變化

細胞處理4 h和12 h后，參照劉瑩等[11]的方法收集細胞。按照試劑盒說明書用TRIzol法提取細胞總RNA。采用PrimeScriptTMRT試劑盒反轉錄總RNA，反轉錄條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反轉錄后的cDNA用于檢測細胞凋亡相關基因的變化，檢測的凋亡基因名稱及其引物序列見表1。qPCR體系如下（20 μL）：SYBR（2×）10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補足至20 μL。qPCR條件設置如下：95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 個循環。采用相對定量法2?△△Ct對基因進行相對定量分析。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western blotting）分析

細胞處理4 h和12 h后，收集細胞，用NP-40充分裂解并提取細胞總蛋白，并用BCA蛋白質量濃度測定試劑盒測定各個樣本的蛋白質量濃度。將蛋白樣品調至等質量濃度后，每組等量上樣，用含質量分數10%十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（80 V 40 min；120 V 40 min）分離。采用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上（轉膜條件：300 mA，冰浴0.5～1.5 h，目的蛋白分子質量越大時間越長）。用含質量分數5%脫脂奶粉的TBS-T封閉膜，搖床上室溫1 h。孵育一抗（兔抗1∶1 000）室溫2 h或4 ℃過夜。洗膜后，孵育二抗（1∶15 000，含熒光的羊抗兔）室溫45 min，TBS-T洗膜后用Odyssey CLx成像系統進行拍照。

1.4 統計學處理

Western blotting圖片采用Image J軟件進行分析。qPCR和Western blotting結果采用 ±s表示，并通過SPSS 22.0軟件進行獨立樣本t檢驗。P＜0.05時認為變化達到顯著性水平，P＜0.01時變化達到極顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 氨基甲酸乙酯對細胞凋亡外源通路的影響

圖1 氨基甲酸乙酯對細胞凋亡基因mRNA表達的影響Fig. 1 Effect of EC treatment on mRNA levels of apoptosis-related genes

圖2 氨基甲酸乙酯對細胞凋亡蛋白的影響Fig. 2 Effect of EC treatment on protein levels of apoptosis-related genes

死亡受體介導的細胞凋亡通路指通過細胞表面特定的受體接受胞外信號誘發細胞凋亡的通路。死亡受體以跨膜形式位于細胞膜表面，胞質內含有死亡結構域（death domain，DD）。在接受到胞外信號后聚合成三聚體而活化，與特定的接頭分子結合，形成死亡誘導信號復合體（death-inducing signaling complex，DISC），從而激活下游信號通路，導致細胞凋亡[12]。TNFRSF10D（DcR2）屬于誘騙受體家族，它同樣能夠識別胞外的死亡信號，但由于缺乏細胞質DD不能將信號傳至胞內，因而能夠通過競爭配體的方式，抑制死亡受體介導的細胞凋亡信號通路[13-14]。4 h和12 h的EC處理，都能顯著提高HepG2細胞中TNFRSF10D基因的mRNA和蛋白水平（圖1、2）。因此，推測EC處理抑制了死亡受體介導的細胞凋亡信號通路。

2.2 氨基甲酸乙酯對細胞凋亡內源通路的影響

細胞凋亡的內源通路是由線粒體介導的，其中，Bcl-2家族作為細胞凋亡調節因子發揮了重要作用[15]。在受到外界刺激后，Bcl-2家族成員之間相互作用，誘導線粒體膜去極化，增大線粒體膜通透性，釋放細胞色素c到細胞質。隨后細胞色素c與細胞質中的凋亡細胞蛋白酶激活因子APAF1結合，形成凋亡復合體，激活Caspase-9（CASP9），啟動Caspase級聯反應，最終誘導細胞凋亡[16]。Bim和Noxa屬于Bcl-2家族促凋亡亞家族。有研究報道它們能夠引發不同細胞的凋亡[17]。4 h EC處理后，與對照組相比，HepG2細胞中Bim、Noxa、APAF1和CASP9基因mRNA水平和蛋白水平都得到顯著提高（圖1、2），同時Western blotting結果顯示活化的Caspase-9片段顯著增加（圖2）。這些結果表明，4 h EC處理已經激活線粒體介導的細胞凋亡內源通路，盡管此時細胞的存活率還沒有顯著的改變[6]。12 h EC處理后，Bim的mRNA和蛋白水平都得到顯著提高（圖1、2）；Noxa、APAF1和CASP9的mRNA水平得到顯著提高（圖1），但它們的蛋白水平卻得到顯著下調（圖2）。因此，12 h EC處理后，盡管細胞凋亡內源通路在轉錄水平仍處于活化狀態，但細胞內細胞凋亡內源通路的蛋白已經開始發生降解。綜上所述，EC處理對細胞凋亡內源通路存在深刻的影響，這可能是EC細胞毒性的一個方面。

2.3 氨基甲酸乙酯對細胞凋亡內質網通路的影響

圖3 氨基甲酸乙酯誘導HepG2細胞凋亡的可能分子機制Fig. 3 Potential molecular mechanisms of EC-induced HepG2 cells apoptosis

內質網引發細胞凋亡主要通過兩個途徑：一是內質網應激反應，二是通過鈣離子介導。IRE1α是內質網膜上的跨膜蛋白，它是UPR近端感受器，能將未折疊蛋白質信號傳入內質網膜，激活內質網應激反應；同時還能活化細胞凋亡信號激酶1（apoptotic-signaling kinase-1，ASK1）促進細胞凋亡[18-19]。肌醇-1,4,5-三磷酸受體（inositol-1,4,5-trisphospate receptor，IP3R）是內質網中細胞內鈣離子通道家族成員，當收到第二信使肌醇-1,4,5-三磷酸的信號后，調控內質網中鈣離子的釋放。胞質中的鈣離子能夠活化鈣依賴性蛋白酶，可直接剪切并激活Caspase-12，引發細胞凋亡[19]。4 h EC處理后，HepG2細胞中IRE1α的mRNA水平顯著提高（圖1），蛋白水平無顯著變化（圖2）。此外，IP3R的mRNA和蛋白水平均顯著提高（圖1、2）。12 h EC處理后，HepG2細胞中IRE1α和IP3R的mRNA水平顯著提高，但其蛋白水平顯著下降。這些結果表明，EC處理可能同時影響內質網應激反應和鈣信號轉導。因此，EC對細胞凋亡的內質網通路同樣存在明顯的影響（圖3），這可能是EC細胞毒性的另一個方面。

2.4 氨基甲酸乙酯對細胞凋亡其他調控基因的影響

除了上述這些細胞凋亡通路外，其他一些調控基因也影響細胞的凋亡[20-21]。本實驗結果也發現，4 h和12 h EC處理后，HepG2細胞中促存活基因GADD45B、原癌基因Fos和促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶MAP3K14（又稱NIK）的mRNA水平均得到顯著提高（圖1）。因為這些基因能夠調控細胞凋亡信號通路，所以EC處理同樣也可能通過影響這些基因的表達來影響細胞凋亡（圖3）。

3 討 論

EC對人體細胞的毒性及毒性作用機制至今鮮有報道。前期研究結果表明EC的細胞毒性具有劑量-時間效應[6]。4 h 100 mmol/L EC處理對HepG2細胞形態和細胞活性均沒有顯著影響；12 h 100 mmol/L EC處理的HepG2細胞形態則出現明顯變化，同時細胞活性和死亡率發生顯著改變[6]。因此，本實驗選取的EC濃度為100 mmol/L，處理時間為4 h和12 h，意圖通過檢測EC處理后細胞凋亡相關基因的mRNA和蛋白質水平的變化，認識人體細胞對EC的早期和晚期生物學反應，并初步探索EC對HepG2細胞的毒性機制。

細胞凋亡是細胞在受到內外刺激后，為維護機體內環境的穩定自主發生的一種程序性死亡。該過程受到一系列基因的精確調控。在不同環境刺激下，通過激活不同基因的表達，誘發不同的信號通路導致細胞凋亡[6-7]。目前，外源藥物誘導細胞凋亡主要是通過3條通路來實施的：線粒體介導的內源通路、死亡受體介導的外源通路和內質網信號通路[16]。本實驗中聚焦上述3個通路相關基因的轉錄和翻譯水平的變化。

4 h和12 h的EC處理能夠顯著提高誘騙受體TNFRSF10D的mRNA水平和蛋白水平。TNFRSF10D受體通過與死亡受體競爭結合胞外死亡配體，從而拮抗死亡受體介導的外源通路，減緩并抑制細胞凋亡。因此，TNFRSF10D的變化可能是HepG2細胞對EC處理的一個應激反應。4 h的EC處理顯著提高了線粒體介導的細胞凋亡內源通路中Bim、Noxa、APAF1和CASP9基因的mRNA水平和蛋白水平，同時顯著提高了細胞凋亡內質網通路中IRE1α和IP3R的mRNA水平及IP3R蛋白水平，表明4 h EC處理已經激活細胞凋亡的內源途徑和內質網通路，引發了細胞凋亡，盡管還沒有明顯的形態學變化。12 h的EC處理同樣顯著提高了這些基因的mRNA水平，并沒有同樣顯著提高它們的蛋白水平（Bim除外）?？梢?，12 h EC處理仍舊通過激活線粒體通路和內質網通路誘導細胞凋亡。因此，這些細胞凋亡線粒體通路和內質網應激通路基因可以視作EC處理反應的分子標志物。細胞凋亡線粒體通路和細胞凋亡內質網應激通路不是孤立的，它們相互影響，相互作用。一方面，Bim作為促細胞凋亡因子，通過結合Bcl-2家族抗凋亡因子，激活線粒體介導的內源通路，促進細胞凋亡；另一方面，內質網應激壓力還能夠通過蛋白磷酸酶2A介導的去磷酸化和CHOP-C/EBPα介導的轉錄誘導，激活Bim蛋白引發細胞凋亡[22]。此外，內質網應激反應造成胞質鈣離子濃度增高，誘導線粒體膜透性增強，胞質內細胞色素c增多，激活線粒體通路促進細胞凋亡[23]；而線粒體內Ca2+穩態的失衡又會引發線粒體ROS水平上升[24]，反過來又加重細胞內質網應激反應。EC對HepG2細胞的毒性檢測結果也證實線粒體通路和內質網通路是相互作用的。

細胞內壓力信號往往具有雙重作用：一方面，細胞受到刺激后會立即激活細胞內生存代謝通路，從而緩沖壓力或修復損傷；另一方面，當細胞受到的壓力或損傷無法修復后，細胞會啟動一系列的死亡程序，如細胞凋亡，從而減少細胞對機體的傷害[22]。有研究顯示，高表達Fos能夠促進細胞凋亡[19]；而GADD45B高表達能夠通過抑制MKK4-JNK信號通路，抑制細胞凋亡[21]。EC處理一方面通過促進GADD45和誘騙受體DcR2的表達抑制凋亡的發生，另一方面又激活細胞凋亡的內源通路和外源通路誘導細胞凋亡。

值得注意的是，12 h EC處理后HepG2細胞內凋亡相關基因的蛋白水平除Bim和TNFRSF10D外，其他的都顯著下降（圖2）。據報道，細胞凋亡過程中Caspase能夠切割翻譯起始因子，從而抑制細胞蛋白合成[25-26]。在凋亡晚期，細胞內形成凋亡小體，并逐漸降解。因此，細胞凋亡過程中蛋白水平不斷下降。有研究表明，Bcl-2家族蛋白是調節細胞凋亡和自噬的中心調節因子，僅含BH3域的蛋白（PUMA、Noxa、Nix和Bim等）能夠引發細胞自噬或凋亡，導致細胞內復合物（核酸、蛋白質等）破壞[27-28]。12 h EC處理后，部分細胞形態發生變化，細胞存活率低于80%[6]，表明12 h處理的樣品中，20%以上的細胞已處于凋亡后期，這可能是蛋白水平下降的一個原因。12 h EC 處理樣品中Bim和TNFRSF10D表達量沒有像其他凋亡蛋白一樣顯著下降的真正原因并不清楚。推測可能有兩個方面的原因。一方面可能源于它們特殊的作用：Bim和TNFRSF10D都是凋亡調控蛋白，不同于其他凋亡蛋白；另一方面可能源于它們EC誘導合成速率和降解速率的差異。內質網是蛋白質合成的場所，EC引起的內質網逆境可能導致細胞內細胞蛋白合成受阻。

總之，100 mmol/L EC處理，即使是4 h的短期處理，也能顯著改變HepG2細胞內細胞凋亡通路部分基因的mRNA和蛋白水平。細胞暴露于EC后，一方面會應激，激活細胞促存活基因和誘騙受體基因，抑制細胞凋亡，修補損傷；另一方面，當EC處理時間延長，損傷無法修復時，會激活細胞凋亡的內外源通路，促進細胞凋亡。人群EC暴露主要來源于發酵食品、煙草制品和污染的空氣[1]，但目前尚無比較全面的人群暴露數據。本研究中所用的EC濃度為100 mmol/L[6-7]，遠遠高于實際生活中人群可能遇到的來自于發酵食品的暴露量[29-30]，所以，進一步的EC毒性分子機制研究應注意采用結合更低的EC劑量和更長的處理時間。