血必凈對免疫抑制膿毒癥模型的保護作用

張晶晶，孔憲斌，霍景瑞，王蕾，劉穎，陳鋒，楊曉暉，田毅，孫世中，陳旭義，黃夢強，劉英富△

膿毒癥是公認的世界性難題［1］，且治療費用非常高昂［2］。隨著年齡的增長，老年人出現(xiàn)免疫低下等狀況，可能會導致膿毒癥的發(fā)病率增加［3］。免疫功能降低是膿毒癥的重要發(fā)病因素，而現(xiàn)有研究在評估藥物或新的治療手段時忽視了免疫抑制的起始因素，直接采用正常動物進行造模實驗，與臨床膿毒癥發(fā)病過程相脫節(jié)［4］，這可能是導致目前膿毒癥有效治療藥物或技術推進緩慢的重要原因［5］。本研究圍繞膿毒癥發(fā)病過程，構(gòu)建了模仿膿毒癥發(fā)病前免疫低下狀態(tài)的新模型，為評估新模型，觀察了經(jīng)典膿毒癥藥物血必凈對新型免疫抑制膿毒癥模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性BALB/c小鼠，清潔級，6～8周齡，體質(zhì)量22～30 g，購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心［北京，中國SCXK-（軍）2012-0004］。小鼠于無病原體的環(huán)境中，自由進食飲水，室內(nèi)溫度（22±2）℃，人工光暗周期12 h，所有實驗均遵循武警后勤學院附屬醫(yī)院動物倫理規(guī)范。

1.1.2 試劑與儀器 環(huán)孢素A購買于美國Med Chem Express公司；血必凈注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；肝素鈉注射液購自山東惠諾藥業(yè)有限公司；大腸桿菌CMCC44102購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；紅細胞裂解液購自美國Solarbio公司；兔抗小鼠HMGB1抗體購自英國Abcam公司；兔抗小鼠β-Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購自Millipore公司。抗小鼠CD3-FITC單克隆抗體、抗小鼠CD4-PE單克隆抗體、抗小鼠CD8-PerCP單克隆抗體購自美國BioLegend公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海喆圖科學儀器有限公司），F(xiàn)ACS CantoTMⅡ型流式細胞儀（美國BD公司），全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司），Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Aplegen公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌懸浮液的制備及濃度測定 將大腸桿菌44102接種于100 mL的無菌培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)12 h，隨后分別在培養(yǎng)基中取1 mL進行稀釋，稀釋梯度為10倍，稀釋到10-9倍。在10-5～10-9稀釋倍數(shù)中各取500 μL倒入裝有無菌瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并順時針轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液充分平鋪，隨后倒置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)皿取出，計平板的細菌菌落形成單位（clonal formation unit，CFU），推算出原液中每毫升的細菌菌落形成數(shù)量（clonal formation unit/milliliter，CFU/mL）。

1.2.2 分組造模 雄性BALB/c小鼠152只，使用隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照（Control）組，免疫抑制（IM）組，免疫抑制膿毒癥模型（ISM）組和血必凈治療（XT）組，每組各38只。IM組：小鼠禁食12 h后，沿下腹正中線旁邊腹腔注射環(huán)孢素A進行免疫抑制，劑量為25 mg/kg，隔日1次，共3次［6-7］。ISM組免疫抑制小鼠后腹腔注射300 μL濃度為1×109CFU/mL的大腸桿菌44102；XT組免疫抑制膿毒癥造模后30 min，腹腔注射血必凈4 mL/kg［6］，30 min后按相同劑量重復注射血必凈1次；Control組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.2.3 流式細胞法測定CD3+CD4+、CD3+CD8+以及CD4+/CD8+造模12 h，各組取10只小鼠，通過取眼球法采血，肝素鈉抗凝，加入紅細胞裂解液處理10 min，至外周血無色清透，1 500 r/min離心5 min。取外周血分別加入抗小鼠CD3-FITC單克隆抗體、抗小鼠CD4-PE單克隆抗體、抗小鼠CD8-PerCP單克隆抗體。劇烈震蕩后，置于4℃冰箱孵育30 min，加入Hanks液洗滌離心，定容并上流式細胞儀檢測。在前散射光（FSC）和側(cè)散射光（SSC）散點圖中，設定淋巴細胞門，然后對淋巴細胞做PerCP、FITC、PE熒光強度檢測。使用流式細胞儀檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+，并用Flowjo軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

1.2.4 血細菌培養(yǎng) 造模8 h，各組取4只小鼠，小鼠眼眶靜脈叢無菌取血，肝素抗凝，各血液標本10倍稀釋后分別取0.5 mL均勻涂布于LB固體平板，37℃孵育18 h，統(tǒng)計菌落數(shù)并拍照，最終的計量單位為菌落形成單位（CFU）。

1.2.5 炎癥因子檢測 造模12 h，各組取10只小鼠，通過取眼球法采血，離心后取血清置于EP管中，-80℃凍存待測，ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6水平。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western blot） 造模12 h，各組取4只小鼠，通過取眼球法采血，離心后取血清置于EP管中，小鼠血清經(jīng)生理鹽水適當稀釋并用還原上樣緩沖液處理后，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，應用濕式電轉(zhuǎn)移法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至預先處理好的PVDF膜上；PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；封閉結(jié)束后，用PBS洗膜3次，加入兔抗小鼠HMGB1抗體（1∶1 000稀釋），室溫孵育90 min；用PBST（內(nèi)含0.05%Tween-20）洗膜3次，每次10 min；加入羊抗兔IgG/HRP（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；暗室內(nèi)加顯色底物顯色曝光并掃描成像。同時以β-Tubulin為內(nèi)參進行校準。實驗結(jié)束后，利用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.2.7 肝腎功能檢測 造模12 h，各組取10只小鼠，通過取眼球法采血，離心并吸取上清液于干凈的EP管中，使用自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和血肌酐（CR）水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CD3+CD4+/CD3+CD8+比值 與Control組比較，IM組和ISM組的CD3+CD4+/CD3+CD8+明顯下降（P＜0.05），與ISM組相比，XT組CD3+CD4+/CD3+CD8+明顯升高（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of CD3+CD4+/CD3+CD8+between four groups圖1 各組CD3+CD4+/CD3+CD8+的比較

2.2 血必凈干預后血細菌培養(yǎng)情況Control組和IM組小鼠血液中未檢出細菌，XT組與ISM組相比，細菌培養(yǎng)明顯減少［（246.75±61.15）CFUvs.（1 726.00±363.52）CFU，t=8.026，P＜0.01］。

2.3 各組IL-6、TNF-α水平變化 與Control組比較,ISM組和XT組釋放IL-6和TNF-α增多（P＜0.05）；與ISM組相比，XT組釋放IL-6和TNF-α減少（P＜0.05）；Control組與IM組差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of IL-6 and TNF-α between four groups表1 各組IL-6、TNF-α的比較 （n=10，±s）

Tab.1 Comparison of IL-6 and TNF-α between four groups表1 各組IL-6、TNF-α的比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與ISM組比較，P＜0.05

組別Control組IM組ISM組XT組F IL-6(ng/L)68.98±4.70 65.39±3.93 87.85±5.08a 82.39±2.35ab 66.408＊＊TNF-α(ng/L)11.94±2.38 10.23±1.71 23.51±2.63a 20.30±1.74ab 88.944＊＊

2.4 各組HMGB1表達水平 與Control組比較，ISM組HMGB1表達水平升高（P＜0.05）；與ISM組相比，XT組HMGB1表達水平明顯下降（P＜0.05）；Control組與IM組差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

Fig.2 Comparison of HMGB1 between four groups圖2 各組HMGB1的比較

2.5 各組肝腎功能比較 與Control組比較，ISM組的ALT、AST、BUN、CR顯著升高（P＜0.05）；與ISM組比較，XT組ALT、AST、BUN、CR明顯降低（P＜0.05）；Control組與IM組差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

3 討論

流行病學顯示嚴重膿毒癥和膿毒癥休克主要集中在老年患者，因膿毒癥死亡的人群中，65歲以上患者約占80%［8］。免疫低下和老年人膿毒癥高發(fā)息息相關，目前有很多膿毒癥的治療方法都在動物研究轉(zhuǎn)化到臨床推進中失敗［9-10］。動物模型不能完全模仿臨床患者是重要因素之一。因此模擬免疫功能抑制的膿毒癥動物模型制備研究，對膿毒癥新型治療方法的研發(fā)與評估，解決膿毒癥免疫調(diào)節(jié)治療方法的爭論具有重要意義。

Tab.2 Comparison of ALT,AST,BUN and CR between four groups表2 各組ALT、AST、BUN、CR的比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of ALT,AST,BUN and CR between four groups表2 各組ALT、AST、BUN、CR的比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較；b與ISM組比較，P＜0.05

組別Control組IM組ISM組XT組F ALT（U/L）43.27±3.58 41.99±2.55 269.67±8.38a 248.49±11.52b 2 870.779＊＊AST（U/L）133.29±5.37 133.46±4.31 326.61±21.91a 305.62±10.03b 713.324＊＊BUN（mmol/L）8.24±0.69 7.93±0.53 37.63±2.40a 34.54±2.57b 801.309＊＊CR（μmol/L）15.38±2.14 15.04±1.17 43.46±3.54a 40.28±2.06b 420.440＊＊

環(huán)孢素A常作為免疫抑制模型制備的藥物［11］，已在人轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌模型等［12-13］研究中得到廣泛應用，而有關免疫抑制膿毒癥模型制備方面的研究，目前鮮見相關研究報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠通過腹腔注射環(huán)孢素A后，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯低于對照組，抑制了小鼠免疫系統(tǒng)，成功模擬了膿毒癥發(fā)病前免疫抑制狀態(tài)，在此基礎上腹腔注射大腸桿菌后成功制備膿毒癥模型。本研究將免疫抑制這一膿毒癥發(fā)病關鍵因素考慮在內(nèi)而制備的新型實驗動物模型，更貼近臨床膿毒癥發(fā)病實際，在一定程度上減少了膿毒癥無效研究的發(fā)生，提高了基礎研究向臨床轉(zhuǎn)化的效率［14］。

為進一步驗證模型的評估效果，本研究選擇了目前臨床常用的藥物血必凈進行干預研究，結(jié)果提示，ISM組的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值低于對照組，出現(xiàn)明顯免疫抑制；與ISM組相比，經(jīng)血必凈干預后，XT組CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值升高，提示血必凈能夠調(diào)節(jié)免疫抑制；與ISM組相比，經(jīng)血必凈治療后，XT組血細菌培養(yǎng)數(shù)量明顯下降。血必凈注射液由赤芍、川芎、丹參、紅花、當歸等組成，其化學成分中含有紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷等21種化合物［15］，是具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡、潰散毒邪功效的復方中藥制劑。本研究結(jié)果也表明其能夠調(diào)節(jié)免疫功能，對抗細菌，降低內(nèi)毒素水平。

本研究提示，與ISM組比較，經(jīng)血必凈治療后XT組TNF-α、IL-6、HMGB1釋放明顯減少，說明血必凈能夠減少免疫抑制膿毒癥小鼠炎癥因子的分泌。與Control組比較，ISM組和XT組的小鼠AST、ALT、BUN、CR顯著升高，提示2組小鼠均出現(xiàn)了肝臟、腎臟的急性損傷。與ISM組相比，血必凈治療后的XT組肝腎損傷相對較輕。早期促炎因子IL-6，TNF-α導致膿毒癥是引發(fā)炎癥過程、氧化應激和多器官損傷的關鍵介質(zhì)，晚期炎癥因子HMGB1是介導器官損傷一種重要的細胞因子，且能夠與炎癥細胞因子相互作用［16］。血必凈干預后，減少了HMGB1、IL-6、TNF-α的釋放，減少炎性滲出，改善微循環(huán)，保護血管內(nèi)皮細胞，有效減少損傷因子對機體重要器官的損害［17-18］。上述結(jié)果提示血必凈對免疫低下膿毒癥模型的療效確切，能夠改善小鼠的預后，新型免疫抑制膿毒癥模型也表現(xiàn)出了貼近臨床的治療效果，同時為血必凈適用于老年膿毒癥患者提供了理論基礎。

目前膿毒癥的治療仍面臨無特異性診斷方法、靶向藥物缺乏、炎癥反應、免疫損害、凝血功能紊亂等復雜問題。免疫抑制新型膿毒癥動物模型的深入研究可能會為探尋膿毒癥治療方法研究，提供新的評判標準。