高遷移率族警報素的表達在非小細胞肺癌患者預后中的意義

劉婷，趙華，魏楓，王揚，任秀寶

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌（non small lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%左右［1］。復發和轉移是影響肺癌預后的重要因素。目前，肺癌仍缺乏早期診斷和判斷預后的有效指標，尋找預后相關指標對于延長患者生存期、提高生活質量有至關重要的意義。高遷移率族（high–mobility group，HMG）蛋 白 由HMGA、HMGB及HMGN三個家族組成。其中HMGB1是細胞內一種含量豐富的非組蛋白染色體結合蛋白，由215個氨基酸組成，含有2個同源性DNA結合區（box A和box B）及一個酸性C末端區［2］；HMGB1自身與DNA有較高的非特異性親和力，參與DNA復制、轉錄和修飾［3］。HMGB1在多種腫瘤組織中高表達，并參與腫瘤的侵襲和轉移［2,4-8,9］。HMGN1是一種高度保守的非組蛋白，人類HMGN1蛋白由100個氨基酸組成。在細胞核HMGN1可通過直接作用于核小體而調節基因表達和影響染色體結構，從而參與多種重要的生物學過程［10-12］。

警報素是一群結構多樣但進化上并不相關的多功能內源性分子，細胞損傷或壞死時其釋放到細胞外。一旦被釋放到細胞外，警報素即可作為內源性的危險信號活化天然免疫細胞［13］。研究發現，HMGB1和HMGN1作為一種警報素在腫瘤治療中發揮重要作用［14-15］。目前，研究已經證實HMGB1和HMGN1具有警報素功能，血清中的HMGN1與NSCLC的轉移和預后相關［14］。但是尚少見HMGN1在NSCLC組織中的表達情況的報道。因此，本研究檢測了NSCLC組織中HMGB1和HMGN1的表達，以探討兩者與NSCLC預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2004年1月—2011年5月就診于天津醫科大學腫瘤醫院的NSCLC患者病理組織石蠟標本91例，并制成石蠟切片。男57例，女34例；＜60歲19例，≥60歲72例；腺癌24例，鱗癌67例；Ⅰ期32例，Ⅱ期26例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例。患者均接受過肺組織切除術或組織穿刺活檢術，經病理確診為NSCLC，并根據國際TNM分期系統進行分期。患者均自診斷之日開始隨訪，隨訪時間2～151個月，中位隨訪時間50個月。本研究獲天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔源多克隆抗HMGN1抗體購于美國Abcam公司，兔源多克隆抗HMGB1抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。DAB顯色試劑盒購于北京中衫金橋生物有限公司；二抗即酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物購于邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組化檢測HMGN1、HMGB1在肺癌組織中的表達情況 石蠟切片脫蠟后用枸櫞酸鹽高溫高壓修復3 min，自然晾至室溫，3%H2O2封閉30 min，PBS洗3遍，一抗4℃孵育過夜，一抗稀釋液比例為1∶300。PBS洗3遍后，于室溫孵育二抗30 min，加新配制的DAB顯色液（1 mL蒸餾水加入50 μL底物A，50 μL底物B，50 μL底物C并充分搖勻），顯色3～5 min，至出現棕色陽性反應。蘇木素染色2～3 min，梯度脫水，晾干后樹膠封片顯微鏡下觀察。隨機觀察5個高倍鏡視野，≥80%腫瘤細胞胞漿著色為陽性表達，＜80%為陰性表達。

1.4 觀察指標 記算患者HMGN1、HMGB1的陽性表達率并比較兩者表達水平的相關性，觀察兩者表達水平與臨床病理特征的相關性以及與無進展生存期（profession free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）的關系。其中PFS定義為從手術日期到腫瘤復發或者轉移，或者是到最后1次隨訪的間隔時間。OS是指從手術日期到患者因腫瘤死亡或者到最后1次隨訪的間隔時間。非腫瘤原因死亡的病例未納入本研究。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行處理。相關性分析用四格表χ2檢驗并計算列聯系數（rs）。HMGB1、HMGN1在不同分期的表達水平比較用非參數檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，利用Log-rankχ2進行生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGN1與HMGB1的相關性HMGB1和HMGN1細胞胞漿的陽性表達率分別為40%（36/91）和31%（28/91），其免疫組化結果見圖1。HMGN1和HMGB1的表達水平呈正相關（rs=0.319，P=0.001），見表1。

Fig.1 The expression levels of HMGB1 and HMGN1（IHC，×400）圖1 HMGB1和HMGN1在細胞漿的表達水平（IHC，×400）

2.2 HMGB1和HMGN1在各個分期的陽性表達率比較 細胞漿HMGN1的表達水平與肺癌的分期有關，晚期肺癌（Ⅲ～Ⅳ期）患者的陽性表達比例顯著高于早期肺癌（Ⅰ～Ⅱ期）患者（P＜0.05），而HMGB1的陽性表達比例在各個分期組差異無統計學意義，見表2。

Tab.1 The correlation analysis of HMGB1 and HMGN1表1 HMGB1和HMGN1表達水平的相關性分析

Tab.2 The positive expression levels of HMGN1 and HMGB1 in different stages of lung cancer表2 胞漿HMGN1和HMGB1在肺癌不同分期的陽性表達率 ［例（%）］

2.3 HMGB1和HMGN1表達與臨床病理特征的相關性HMGB1的表達水平與吸煙有關，吸煙者陽性率更高（P＜0.05），而與年齡、性別、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移無關；HMGN1的陽性表達率在有淋巴結轉移者中更高（P＜0.05），而與年齡、性別、有無吸煙、病理類型和遠處轉移無關，見表3。

Tab.3 Correlation between cytoplasmic expressions of HMGN1 and HMGB1 and clinical parameters of NSCLC patients表3 NSCLC患者HMGN1、HMGB1胞漿陽性表達率與臨床病理特點的相關性 ［例（%）］

2.4 HMGB1和HMGN1與預后的相關性 單因素分析顯示，在不同性別、年齡是否大于60歲、有無吸煙史、HMGN1和HMGB1表達情況間中位PFS差異無統計學意義，而病理類型為腺癌、早期肺癌（Ⅰ～Ⅱ期）、無遠處和淋巴結轉移者中位PFS較長，生存質量較好（P＜0.05）；在年齡是否大于60歲、有無吸煙史、病理類型、HMGN1和HMGB1表達情況間中位OS差異無統計學意義，而男性、早期肺癌、無遠處和淋巴結轉移的中位OS較長，生存質量較好（P＜0.05），見表4。HMGB1陰性表達組和陽性表達組的5年累積PFS率分別為57.9%和49%，5年累積OS率為55.9%和36.1%，HMGN1陰性表達組和陽性表達組的5年累積PFS為59.2%和43.3%、5年累積OS為55.0%和32.1%，見圖2。

Tab.4 Univariate analysis of influencing factors for prognosis of NSCLC表4 影響NSCLC預后的單因素分析

3 討論

高遷移率族蛋白是一組非組蛋白核小體結合蛋白，它們通過與染色體結合調節DNA的轉錄、復制及損傷修復［16］。其中HMGB1和HMGN1被發現與腫瘤的發生發展以及侵襲轉移有密切關系，并且可以預測NSCLC的預后。HMGB1最初被認為主要是作為一種重要的晚期炎癥介質介導膿毒癥的病理過程，此作用依賴于干擾素β（IFN-β）介導的JAK/STAT信號通路；后續研究發現，HMGB1還參與自身免疫性疾病、缺血再灌注損傷等多種非感染性炎癥疾病的病理過程［17］。有研究表明，HMGB1在多種腫瘤組織中高表達，參與腫瘤的發生、發展［3，18］。

Fig.2 Correlation of HMGN1 and HMGB1 expression levels and prognosis圖2 HMGN1、HMGB1胞漿表達水平與預后的關系

在高遷移率蛋白家族中，HMGN1和HMGB1具有警報素的作用，可募集和活化樹突狀細胞（DC）等免疫細胞發揮增強免疫的作用。HMGB1對腫瘤的作用具有雙向性，一方面，HMGB1調控腫瘤相關基因的表達，影響腫瘤組織局部微環境，促進腫瘤血管新生，為腫瘤的生長、轉移提供有利條件。另一方面，腫瘤細胞會分泌HMGB1，其與Toll樣受體2（toll like receptor2，TLR2），或者TLR4相互作用激發抗腫瘤免疫反應。HMGN1的作用與其所在的位置有關，細胞核的HMGN1能夠調節基因轉錄并通過直接結合核小體影響染色體結構［19-20］；而分泌到細胞外的HMGN1可通過與DC的相互作用啟動TLR/MyD88信號通路，增強DC抗原提呈能力，激活T細胞，提高抗腫瘤免疫反應［13,21］。同時筆者團隊在前期研究中發現，HMGN1和HMGB1的表達水平與CD3+和CD8+細胞的數量呈正相關，這可能提示HMGN1和HMGB1也可能募集T淋巴細胞而發揮抗腫瘤作用［22-23］。

HMGB1的釋放主要是由于蛋白的核質轉位或細胞膜被破壞，而目前尚缺乏HMGN1分泌機制相關文獻報道，由于腫瘤組織內分泌的HMGB1和HMGN1無法檢測，因此可以將胞質中的表達認為是細胞存在向胞外分泌情況。本研究檢測了胞漿中HMGB1和HMGN1的表達，發現HMGN1與HMGB1的胞漿表達水平呈一定相關性，同時發現晚期肺癌患者的HMGN1陽性表達率比早期肺癌組織顯著升高，但是Ⅳ期肺癌患者中HMGN1的水平與Ⅲ期相比卻降低。這一結果與Wei等［14］的結果一致，表明HMGN1與腫瘤分期有關，但是Ⅳ期中HMGN1水平降低，推測原因可能是由于在腫瘤的不同發展階段HMGN1發揮的作用不同，早期HMGN1主要在細胞核中存在，隨著腫瘤的進展，刺激HMGN1開始從細胞核遷移至細胞質，進而分泌到外周開始發揮抗腫瘤的免疫作用，因此細胞質中HMGN1的表達水平隨著分期而升高。而在發生轉移的Ⅳ期肺癌患者中，HMGN1遷移水平降低，可能是因為腫瘤轉移導致發生免疫逃逸，而限制了HMGN1的警報素作用。

本研究發現HMGN1的表達水平與淋巴結轉移有關，提示高HMGN1表達水平發生更易發生淋巴結轉移，同時腺癌的中位PFS較長，這可能與腺癌目前對于靶向藥物的敏感性高有關。另外本研究中男性的中位OS長于女性，這與既往的認知有一定的矛盾，一般男性吸煙人群較多，因此相比女性患肺癌率高，預后較差，這一結論仍舊需要納入更大樣本的驗證。本研究結果發現胞漿中HMGN1和HMGB1表達水平越高，越可能發生淋巴結轉移，這也與以上的推測一致，表明HMGN1和HMGB1可能預示淋巴結轉移。同時本研究發現HMGN1與OS有一定的相關性，HMGN1表達越高，預后越差，雖然這一結論沒有達到統計學差異，但也預示HMGN1可能成為預后的預測指標，今后需要擴大納入病例數對預后進行深入研究。

綜上所述，HMGN1和HMGB1在腫瘤發展中的作用具有雙相性，在不同的發展階段和位于不同的位置，其產生的作用不同。因此，需要準確地把握HMGN1和HMGB1的作用時機，最大限度地發揮兩者的警報素作用，進而募集免疫細胞發揮抗腫瘤免疫作用。今后需要更加深入的基礎研究和臨床研究來進一步探討高遷移率蛋白的作用，為NSCLC的治療提供新的思路。