APP/PS1轉基因AD小鼠腦內淀粉樣斑塊與鐵沉積的磁敏感成像研究

劉浩蒂，鄭陽，王曉明

作者單位：

中國醫科大學附屬盛京醫院放射科，沈陽 110004

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理改變是神經細胞外Aβ蛋白聚集形成的淀粉樣斑塊和神經元內tau蛋白過度磷酸化聚集形成的神經纖維纏結。目前應用MR技術在體顯示淀粉樣斑塊的技術主要分兩類，一類是應用Aβ蛋白來標記對比劑，靶向結合淀粉樣斑塊對其進行顯影。有研究成功應用Aβ1-40標記的釓噴酸葡胺顯示小鼠腦內的淀粉樣斑塊[1]，但該技術的弊端是標記后的對比劑分子較大，必須破壞血腦屏障后才能進入腦組織，并且具有一定毒性，所以只用于動物實驗或是腦組織尸檢研究。另一類是通過探測淀粉樣斑塊內及周圍的鐵沉積來顯示斑塊，并且通過定量分析鐵沉積來間接反映斑塊數量，這種技術可以敏感地探測到由鐵沉積造成的斑塊周圍弛豫信號改變，無需引入對比劑及破壞血腦屏障，可以直接進行活體顯像[2-3]。

目前，可用于定量檢測腦組織鐵含量的磁共振方法有探測弛豫信號變化的弛豫率增高信號(field-dependent R2 increase，FDRI)及探測相位信號變化的磁敏感技術等[4-8]。三維增強磁敏感成像(3D-enhanced susceptibility weighted angiography，ESWAN)是一種改良的磁敏感技術，它采用梯度回波的自由感應衰減和回波采樣序列進行三維圖像采集，消除了水等異常信號對鐵沉積信號的影響，并且應用了高通濾波等后處理技術，去除了由于場強不均造成的噪聲偽影，增強鐵沉積區域的相位改變，可以更敏感地探測到鐵信號[9]。本研究應用ESWAN來探測小鼠腦內鐵沉積，用平均相位值(mean phase value，MPV)表示，并研究其與鐵蛋白及淀粉樣斑塊分布的相關性。

1 材料與方法

1.1 動物模型

APPswe/PSEN1de9基因突變型小鼠(購自美國Jackson Laboratory，簡稱為APP/PS1轉基因小鼠，該轉基因小鼠由中國醫科大學實驗室購買，實驗室繁育，每一只小鼠確定攜帶基因后方進行MRI掃描及組織學檢測)及年齡匹配的非轉基因野生型小鼠(C57BL/6)各5只，均為雌性，按照6月齡、12月齡、18月齡分組。實驗動物麻醉采用腹腔內注射異戊巴比妥鈉(2%戊巴比妥鈉40 mg/kg)，麻醉后進行MR成像及組織學檢測。

1.2 MR掃描

1.2.1 圖像采集

采用GE Signa HDxt 3.0 T 超導MR掃描儀，四通道相陣控小動物線圈，行常規T2WI、T1WI進行圖像定位及ESWAN序列掃描。設備參數：冠狀位T2WI，采用快速自旋回波序列(fast spin echo，FSE)序列，TR=4680 ms，TE=85 ms，矩陣=288×256，NEX=4，層厚=1.5 mm，間距=0.3 mm；冠狀位T1WI，采用FSE序列，TR=480 ms，TE=min full，矩陣=256×192，NEX=8.0，層厚=1.5 mm，間距=0.3 mm；ESWAN采用高分辨率的三維擾相梯度回波(3D-spoiled gradient recalled echo，3D-SPGR)序列，自動TR=7.1 mm，回波鏈長度=14，層厚=1.5 mm，矩陣=288×256，激勵次數4次，接受帶寬=31.25 Hz。

1.2.2 圖像后處理

ESWAN原始掃描數據傳至Advantage Workstation 4.4(Sun Microsystems，Santa Clara，Calif)，應用研究軟件Functool 9.4.05a(GE Healthcare)進行去噪及濾波處理(64×64)后，同時得到強度圖和相位圖，應用T2加權圖像進行定位，勾畫皮質區、海馬區及丘腦區作為感興趣區(region of interest，ROI)(如圖1所示)，將ROI鏡像復制至ESWAN相位圖和強度圖，讀取MPV。

1.3 免疫組織化學染色

MR檢查后小鼠開胸從左心室插管至升主動脈，先灌注0.9%生理鹽水30 ml，隨后灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液30 ml，取腦后將其置于上述固定液中12 h。然后將腦組織置于70%、80%、95%及100%的酒精梯度脫水，浸蠟，組織塊包埋后行石蠟切片，片厚約為50μm。

切片脫蠟后用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)沖洗，山羊血清封閉室溫下30 min后甩掉，淀粉樣斑塊顯色滴加Aβ蛋白(1～40)抗體作為一抗，鐵蛋白顯色滴加鐵蛋白抗體作為一抗，4℃孵育過夜；第2天用0.01 ml PBS 3次清洗后滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)，37℃孵育30 min；二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色15～20 min，鏡下控制反應時間，充分水洗；蘇木素復染，流水沖洗。常規脫水，透明和封片。用PBS代替一抗，排除二抗的非特異性染色，結果為陰性。

表1 模型組不同年齡組APP/PS1小鼠皮質、海馬、丘腦區MPV及方差分析結果Tab.1 Results of MPV and variance analysis of cortex,hippocampus and thalamus in APP/PS1 mice of different age groups

在NIKON光學顯微鏡下對動物左側丘腦區、海馬區及皮質區進行觀察并采集圖片。每只小鼠檢測3張相同部位切片，應用NIS-Elements軟件對圖像進行觀察分析，每張切片檢測3個視野(10×objective)。計數每個視野所有的Aβ、鐵蛋白染色斑塊個數，及陽性染色斑塊所占總面積百分比。

1.4 統計學分析

應用IBM SPSS 19.0進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示。每個感興趣區內轉基因小鼠與對照組小鼠的MPV采用獨立樣本t檢驗；采用ANOVA方差分析檢驗每個感興趣區內各月齡組小鼠的MPV及組織學斑塊統計結果的差異性；相同感興趣區MPV與斑塊數量、斑塊面積百分比相關性分別應用Pearson相關分析檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

轉基因小鼠中，Aβ蛋白陽性斑塊與鐵蛋白陽性斑塊均呈深褐色(見圖2)，Aβ蛋白斑塊染色較深，并且部分較大斑塊在中心可觀察到深染的類圓形核心；鐵蛋白斑塊染色較淺，斑塊內染色均勻。在轉基因小鼠組中，同一ROI內小鼠的Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊數量和范圍差異均具有統計學意義(見表1)。

表2 模型組感興趣區平均相位值與組織學參數的相關性Tab.2 The correlation coefficient between the average value of the area of interest and the histological parameters

圖1 APP/PS1轉基因小鼠腦MPV測量ROI示意圖。A、B為對照組磁矩圖及相位圖，C、D為AD組磁矩圖及相位圖。P為皮質區，H為海馬區，T為丘腦區Fig. 1 The ROI selection of MPV measurement of APP/PS1 transgenic AD rat brain MR scan image. A, B are the magnetic moment diagram and phase diagram of the control group, C, D are the magnetic moment diagram and phase diagram of the AD group. Region P: Cortical area, H: Hippocampal area, T:Thalamic area.

視野內斑塊數量的計數結果顯示，18月齡的APP/PS1小鼠腦內感興趣區內Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊數量都明顯高于前兩組，并且斑塊范圍也較其他組增大(見圖3、4)。在6月齡組，所有的ROI內沒有觀察到鐵蛋白的沉積，在部分小鼠海馬區和皮質區觀察到少量淀粉樣斑塊沉積。在相同的ROI內，淀粉樣斑塊與鐵蛋白斑塊在數量與范圍上都分別具有相關性(相關系數見表2)。

圖2 海馬區淀粉樣斑塊(A)與鐵蛋白斑塊(B)免疫組化染色(× 400) 圖3 APP/PS1小鼠Aβ40免疫組化染色圖像(× 100)。A～C為4 m小鼠腦皮質區、海馬區及丘腦區圖像；D～F為10 m小鼠上述3個部位圖像；G～I為16 m上述3個部位圖像。深棕色為陽性染色斑塊，即老年斑圖4 APP/PS1小鼠鐵蛋白免疫組化染色圖像(× 100)。A～C為4 m小鼠腦皮質區、海馬區及丘腦區圖像；D～F為10 m小鼠上述3個部位圖像；G～I為16 m上述3個部位圖像。淺棕色為陽性染色斑塊，即鐵蛋白集中局域Fig.2 Amyloid plaques (A) and ferritin plaques (B) immunohistochemical staining (× 400) in the hippocampus. Fig.3 APP/PS1 mouse Aβ40 immunohistochemical staining (× 100). A—C show 4 m mice brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Dark brown is a positive staining for plaques (senile plaques). Fig.4 APP/PS1 mouse ferritin immunohistochemistry staining (× 100). A—C show the 4 m mouse brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Light brown is a positive stain (the concentration of ferritin).

圖5 不同月齡模型鼠腦內皮質、海馬、丘腦內MPV、鐵蛋白及Aβ斑塊分布Fig. 5 Distribution of MPV, ferritin and Aβ protein patch in the cortex, hippocampus and basal ganglia in transgenic mice.

對照組中，僅在18月齡組內觀察到少量Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊，6月齡及12月齡組小鼠腦內未觀察到上述斑塊的沉積。

2.2 ESWAN結果

轉基因組小鼠腦內皮質區(t=-2.201，P=0.045)與海馬區(t=-2.524，P=0.024)的MPV差異均有統計學意義，而丘腦區的MPV差異無統計學意義(t=-2.094，P=0.055)。對照組小鼠各區域內MPV組間差異均無統計學意義。18月齡的轉基因小鼠皮質區及海馬區的MPV要明顯低于對照組，而丘腦區兩組的MPV未見明顯差異(見圖5)。轉基因組小鼠相同感興趣區不同年齡組的MPV值差異具有統計學意義，并且平均相位值由低年齡組向高年齡組遞減，比較轉基因小鼠組不同感興趣區的MPV的均值可見，皮質區的MPV在各月齡組均最低(見表1)。轉基因小鼠腦內相同的感興趣區MPV與組織學分析所得鐵蛋白的數量和范圍分別具有顯著相關性(見表2及圖6)。模型鼠中，腦內MPV值與鐵沉積、Aβ斑塊的數量及其所占面積百分比呈正相關。

圖6 腦內MPV值與鐵蛋白、Aβ斑塊相關性分析Fig. 6 The correlation of MPV, ferritin and Aβ protein patch in brain.

3 討論

3.1 APP/PS1基因突變型小鼠

本研究應用的模型組小鼠為APP/PS1基因突變型小鼠，它可以同時表達人鼠嵌合型APP基因與人類早老素1基因，這兩種基因都出現在家族性AD患者中[10]。研究表明，PS1基因的轉入可以使鼠腦內形成老年斑的時間縮短，以往研究報道APP/PS1雙轉基因小鼠模型在5～7個月就出現老年斑，并且表現出空間學習能力降低和記憶力的減退[11]，而本研究動物模型6 m組部分小鼠腦內可觀察到淀粉樣斑塊，這與以往研究是相符合的。并且隨著年齡的增長模型組小鼠腦內Aβ斑塊的數量逐漸增加，尤其是在皮質區及海馬區域內，這也與Izco等[12]和Ferguson等[13]的研究符合。

3.2 ESWAN技術的優勢

以往應用MR在體定量研究小鼠腦內鐵含量的技術多為計算組織的FDRI，大量研究證明FDRI與鐵含量成線性相關，可以定量分析組織內鐵含量[14-16]。但是這種技術要收集同一受試體至少兩個場強的弛豫率，然后計算獲得FDRI，因此在變換場強的操作中不可避免地會產生系統偏倚，影響信號的準確性。并且應用弛豫率信號反映鐵含量時，不可避免地會受到水等影響弛豫率物質的影響，這就降低了FDRI的特異性[17]。本研究應用的ESWAN技術，主要分析的是順磁性物質鐵存在造成的周圍磁場相位信號的改變，根據公式Δψ(phase)=-rΔBTE(r為磁旋比，ΔB為組織間的場強變化，TE為回波時間)和ΔB=cVΔxB0(c為鐵含量，V為體素體積，并且Δx是鐵存在導致的分子間磁敏感差異性)，可以推出在相同的TE條件下，相位信號與鐵含量呈負相關，獲取感興趣區的相位信息只需要一次掃描就可完成，并且由上述公式可以看出，相位信號受其他物質影響較小，因此在反映組織內鐵含量時有較好的特異性。然而磁敏感加權成像圖像常伴有磁敏感偽影，這種偽影主要生成于原始圖像中的相位圖像，磁敏感偽影出現在不同磁化率組織的交界面上，主要是由于磁化率的不同導致局部磁場變化，造成質子自旋失相位，產生相位差異，經傅里葉重建之后圖像變形，部分信號丟失[18]。本研究結果顯示ESWAN技術測量得到鼠腦感興趣區平均相位值與鐵蛋白的數量與斑塊范圍均呈現相關具有統計學意義，進一步驗證了上述理論，說明相位值的變化與鐵沉積具有相關性。

3.3 APP/PS1轉基因小鼠腦內鐵沉積與相位值

本研究發現AD模型組小鼠的皮質區與海馬區的MPV值隨月齡增長而降低，這說明鐵沉積隨月齡增大持續增多，而在對照組小鼠的MPV值組間差異并沒有統計學意義，Gao等[9]應用MR弛豫時間技術研究相同模型小鼠腦內鐵沉積時，只在丘腦區域得到了類似結論，而在皮質區及海馬區模型組與對照組都沒有發現明顯的隨年齡變化的鐵沉積規律，這有可能與該研究應用的MR技術對組織水造成的弛豫時間改變敏感，而皮質和海馬周圍都存在大量腦脊液(結構比鄰蛛網膜下間隙與側腦室)，造成這兩個區域鐵沉積分析特異性差所致。而在健康人腦鐵隨年齡變化的研究[19]與AD患者腦鐵沉積研究中都有與本研究相似的規律報道[18]。在APP/PS1轉基因小鼠的研究中發現，18 m組各感興趣區的相位值明顯低于6 m與12 m組，提示在老齡APP/PS1轉基因小鼠腦內鐵沉積可能是持續進行的。人類腦鐵沉積在正常情況下，某些特定部位(基底節區、海馬等)也有與正常鼠腦相似的規律，即在正常人30歲左右處于停滯狀態[19-21]，但是在AD病理狀態下，鐵沉積表現出與疾病發展明顯程度相關[17]。

本研究還顯示不同部位的相位值存在差異，轉基因小鼠皮質區MPV最低，說明該區域腦鐵含量明顯低于海馬區與丘腦區。皮質區與海馬區被公認為老年斑沉積范圍及數量較多的區域，以往研究已證實隨著年齡和病程的進展其斑塊分布與鐵沉積具有相關性，但是對于丘腦區的研究仍存在爭議。Westland等[3]認為在丘腦區的鐵沉積可能與微出血等病理狀態相關，在該區域內并沒有表現出明顯的AD淀粉樣斑塊相關的鐵沉積，Dhenain研究除了在丘腦區發現大量低信號斑塊外并沒有在皮質和海馬區發現鐵沉積相關的低信號斑塊。但是在本研究中卻得到了與其相反的結論，結合鐵蛋白免疫組化結果發現，在皮質區與海馬區，發現隨年齡增長出現大量與淀粉樣斑塊相關的鐵蛋白沉積，并且測量到MPV值明顯降低，更支持了鐵沉積的存在。在丘腦區，尤其是月齡較高的轉基因小鼠腦組織內，本研究同樣發現了與淀粉樣斑塊相關的鐵蛋白陽性斑塊，證明丘腦區的淀粉樣斑塊與鐵沉積是具有相關性的。筆者認為與前人研究產生這一矛盾結論的主要原因可能是Dhenain研究所應用的MR技術無法有效鑒別丘腦區低信號斑塊的成分組成，如鈣等其他會影響弛豫時間改變及信號改變的物質，而ESWAN技術可以針對性地對鐵進行顯示，并且進行相應的定量測量。

4 結論

本研究顯示APP/PS1轉基因小鼠腦內皮質區、海馬區及丘腦區的鐵沉積持續進行，并且與淀粉樣斑塊的形成具有相關性，ESWAN技術平均相位值的改變與鐵沉積具有明顯相關性，為在體定量研究腦組織鐵沉積提供了新的方法。