基于間酪氨酸和鄰酪氨酸鑒定輻照海產品

邵宏宏，相興偉*，鄭 斌，周秀錦，周宇芳，周向陽，傅謐妮

（1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316000）

海產品的新鮮度是其品質的重要指標，輻照作為一種新興的加工技術，因其高效的殺菌作用，在全球食品加工領域得到了廣泛應用[1]，近年來，在海產品加工、運輸及儲存過程中利用輻照技術進行殺菌保鮮，以達到最大限度延長貨架期的目的[2-3]。目前，由于輻照對食品的品質和安全性的影響還尚未定論[4-5]，歐盟、美國等發達國家均要求進口輻照食品應有國際食品輻照標識（1999/2/EC）。我國出口歐盟及日本的海產品多次發生由于無輻照標識而被退貨的事件，給企業造成巨大經濟損失。

目前，關于輻照食品檢測方法研究的報道很多，但是受方法本身采用的原理所限，每種方法均適用于特定類型的樣品[6-14]，由于海產品脂肪含量少，且常采用多次漂洗、蒸煮、烘烤等加工方式，采用現行的方法在檢測輻照海產品存在一定難度，如采用熱釋光法需在樣品中提取一定量的硅酸鹽，而魚肉、魷魚絲等產品由于受加工工藝影響，無法提取到足夠量的硅酸鹽用于檢測[15-16]。食品中苯丙氨酸經輻照后，在氧化壓力條件下，與輻照產生的羥自由基反應，產生酪氨酸3 種異構體——對酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸[17]。由于機體本身并不存在間位酪氨酸和鄰位酪氨酸，因此，可通過對其含量進行測定作為含蛋白質食品是否經過輻照的判斷依據。但食品經輻照后只產生微量的酪氨酸同分異構體且較難分離，相對而言，在輻照生成的酪氨酸異構體中，鄰酪氨酸的量最大[18]。因此在目前關于酪氨酸同分異構體檢測的報道中，主要選用鄰酪氨酸作為檢測含蛋白質輻照食品的探針化合物，利用高效液相色譜法應用柱前衍生化或直接經反相高效液相色譜分離檢測，但存在衍生化產物不穩定、試劑昂貴，重現性差等問題[19-21]。Chen Si等[22]利用輻照后氨基酸特異性產物對輻照肉類的檢測進行了相關研究。劉茜等[23]建立了高效液相色譜-串聯質譜技術檢測輻照蛋白質類功能食品中鄰酪氨酸和間酪氨酸的方法。但目前對海產品輻照研究的報道較少，此外關于鄰酪氨酸和間酪氨酸作為海產品輻照產物的特異性和穩定性研究鮮見報道。

本研究采用高效、高靈敏度的超高效液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole linear ion trap tadem mass spectrometry，QTRAP-UPLC-MS/MS）技術，以及精確的多反應監測-信息關聯采集-增強子離子（multiple reaction monitoring information-dependent acquisitionenhanced product ion，MRM-IDA-EPI）監控模式，對不同海產品中的酪氨酸同分異構體進行有效分離和二次定性，準確測定海產品中輻照標識物含量。在此基礎上，對不同加工方式處理后的各類海產品及其加工制品中鄰酪氨酸和間酪氨酸進行檢測，對鄰酪氨酸和間酪氨酸作為輻照標識物的特異性進行研究；不同加工方式和前處理方式對輻照衍生物穩定性的影響；測定不同劑量輻照后多種海產品中輻照標識物的含量，確定海產品的種類和氨基酸含量對輻照檢測的影響，為輻照海產品的鑒定檢測提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙酮、甲醇（均為色譜純） 德國默克公司；去離子水（電阻率18.2 MΩ?cm），經0.22 μm微孔濾膜過濾后使用；甲酸 德國Riedel deHaen公司；氨基酸標準品：DL-酪氨酸 （CAS：556-03-6，純度≥99.0%）、間酪氨酸（CAS：775-06-4，純度≥99.0%）、鄰酪氨酸（CAS：2370-61-8，純度≥98.0%）、丙苯氨酸（CAS：150-30-1，純度≥99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

UPLC-20ADXR系列液相色譜（配有溶劑脫氣裝置、自動進樣器） 日本Shimadzu公司；QTRAP 5500三重四極桿復合離子阱質譜儀 美國AB Sciex公司；天平（感量0.000 1 g）；超聲波清洗器 德國Elma公司；MSI漩渦振蕩器 德國IKA公司；3-18K低溫高速離心機美國Sigma公司；恒溫干燥箱 美國Thermo Fish公司；自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

為保證樣品的新鮮度且未經加工處理，無任何添加劑處理，選取浙江舟山及東海區域典型且出口量較大的海產品。海水魚類選取鮐魚（Pneumatophorus japonicus），海水甲殼類選取大管鞭蝦（Solenocera melantho）又稱紅蝦，是目前浙江舟山市出口量最大的蝦類產品。水產制品選取頭足類的魷魚，并加工成干制魷魚絲[24]。

各類海產品均來自于浙江舟山市各大水產加工企業，實驗中采用的未輻照樣品為來自于水產企業未經任何加工處理的水產樣品，干制品為加工后未經輻照處理的樣品；輻照樣品為經γ射線（60Co為放射源）輻照處理的樣品，用劑量計跟蹤測定樣品的吸收劑量；新鮮海捕水產品及制品取可食部分，凍制品等解凍后勻漿于-20 ℃保存備用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取0.8 g經勻漿后的樣品于10 mL塑料離心管中，加入3 mL 體積分數為0.1%甲酸溶液，均質1 min，室溫超聲振蕩提取30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。將上清液轉移至另一離心管中，加入8 mL丙酮，于-18 ℃靜置2 h，沉淀蛋白質，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL置于玻璃管中。35 ℃條件下N2吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液溶解，用0.22 μm水相尼龍濾膜過濾，上機待測。

干制海產品由于含水量低，其游離氨基酸含量少，因此需通過酸水解的方式對輻照產物進行提取。將待測的干制水產品充分混勻，用剪刀剪碎，尤其是魷魚絲，避免纏繞住粉粹機刀頭使之過載；攪碎后裝入容器內，密封、冷藏（-18 ℃）備用；準確稱取0.5 g，經前處理后的樣品于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮氣后蓋緊旋蓋，于110 ℃酸解過夜。取酸解液用濾紙過濾后，置于玻璃離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液5 mL，35 ℃條件下N2吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液溶解后過濾膜待測。

1.3.3 色譜及質譜條件

1.3.3.1 色譜分離條件

采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流速0.4 mL/min；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；進樣量：2 μL；柱溫：35 ℃；流動相的梯度洗脫程序為：0～5 min，5%～30% B，5.1～8 min 30%～5% B，對色譜柱進行沖洗，結束整個檢測流程。

1.3.3.2 質譜條件

離子源Turbo V，電離模式電噴霧電離，正離子模式；采集方式MRM模式，離子化溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力55 psi，輔助氣壓力60 psi，氣簾氣壓力30 psi，碰撞氣壓力為 High；入口電壓10 V，碰撞室出口電壓13 V。各化合物的具體采集參數見表1。

采用MRM-IDA-EPI模式監測。MRM觸發增強子離子掃描IDA-EPI條件：IDA觸發信號強度閾值5 000；EPI條件：掃描速率10 000 Da/s；掃描范圍：50～200 Da；離子源同載氣條件同MRM；DP電壓80 V；碰撞能量35 V，碰撞能量譜寬為15。

表1 優化的質譜條件參數Table 1 Optimized MS/MS parameters for determination of the isomers

1.3.4 其他測定方法

水分含量測定：采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法[25]；脂肪含量測定：采用GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[26]；蛋白質含量測定：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[27]；氨基酸含量測定：采用 GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[28]。

2 結果與分析

2.1 主要成分及氨基酸含量

同一種海產品的苯丙氨酸和酪氨酸含量會隨所處環境、捕獲季節、所處的生長期等多種因素的影響[29]。輻照樣品中的鄰酪氨酸和間酪氨酸由苯丙氨酸經氧化后產生，為探明海產品中不同苯丙氨酸和酪氨酸含量對輻照產物的影響，對鮐魚、大管鞭蝦及干制魷魚絲中苯丙氨酸和酪氨酸及相關成分含量進行了測定，結果見表2。大管鞭蝦中水分含量最高，不同的海產品中蛋白質質量分數在16.7%～26.2%之間。鮐魚中具有較高的脂肪含量，海產品主要成分因海產品種類不同而存在差異。

表2 海產品成分分析（n=3）Table 2 Chemical composition of seafood (n= 3)

2.2 輻照劑量對標識物標準品的影響

取質量濃度為1 mg/L的苯丙氨酸、對酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸標準水溶液，分別進行0.5～50 kGy不同劑量的輻照，與未經輻照的苯丙氨酸標準水溶液均用QTRAP-UPLC-MS/MS進行測定。結果顯示（圖1、2）在未經輻照的苯丙氨酸標準溶液中，只檢測到苯丙氨酸，而經不同劑量輻照后溶液中檢測到不同濃度的對酪氨酸、鄰酪氨酸及間酪氨酸（表3），產生的3 種酪氨酸同分異構體含量隨接受到的輻照劑量增大而增加，呈現良好的線性關系（表4）。

圖1 苯丙氨酸MRM圖Fig. 1 MRM chromatogram of phenylalanine

圖2 輻照后苯丙氨酸MRM圖Fig. 2 MRM chromatogram of phenylalanine after irradiation

表3 苯丙氨酸輻照后酪氨酸含量（n= 3）Table 3 Contents of tyrosine isomers after irradiation of phenylalanine (n= 3)

表4 苯丙氨酸輻照產物線性方程Table 4 Linear equations for tyrosine isomers

苯丙氨酸溶液用高純度的苯丙氨酸標準品與經過高溫消毒的去離子水配制，不含其他酶及其他物質，接受輻照后產生酪氨酸同分異構體，由此可知苯丙氨酸接受輻照產生酪氨酸這一過程不需要酶及其余物質的參與。

在低劑量輻照下，在3 種輻照產物中對酪氨酸的含量最高，鄰酪氨酸次之；隨著輻照劑量的加大，間酪氨酸含量迅速上升，當輻照強度為5 kGy時，3 種同分異構體含量最為接近；輻照劑量上升至10 kGy時，由苯丙氨酸輻照產生對酪氨酸、間酪氨酸和鄰酪氨酸的質量百分比分別為0.36%、0.47%和4.9%；為當輻照劑量高達50 kGy時，鄰酪氨酸和間酪氨酸質量濃度分別達到19.971 μg/L和19.540 μg/L，超過對酪氨酸的13.892 μg/L。

同時，分別經不同劑量輻照的對酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸3 種標準溶液中無其他物質的出現，其含量無變化。對酪氨酸的標準溶液即使經高劑量的輻照也無法產生其他兩種同分異構體，鄰酪氨酸和間酪氨酸亦然，因此，輻照不能使這3 種酪氨酸相互轉化，且不影響這3 種同分異構體的穩定性。

2.3 加工方式對輻照標識物的影響

分別采用海產品加工中常用的方法對不同海產品進行處理，檢測處理后的樣品中有無鄰酪氨酸和間酪氨酸產生，研究其他加工方式是否會導致這兩種同分異構體的產生。實驗中采用了3 種加工方式：100 ℃蒸煮30～60 min；150 ℃烘烤2 h及50 ℃干燥24 h。經加工后的樣品前處理后上機檢測，結果顯示經50 ℃干燥24 h、100 ℃蒸煮30 min和150 ℃烘烤2 h后的樣品中無鄰酪氨酸和間酪氨酸產生，但經100 ℃蒸煮60 min后的部分樣品中有微量鄰酪氨酸產生，但未檢測到間酪氨酸。因此采用液相色譜只對食品中的鄰酪氨酸進行測定從而判斷食品是否進行輻照的方法易出現假陽性的結果。本實驗采用同時檢測鄰酪氨酸和間酪氨酸的含量對輻照海產品進行鑒定，因此對樣品進行100 ℃蒸煮60 min的處理不會影響輻照與否的鑒定，將鄰酪氨酸和間酪氨酸作為輻照標識物可作為輻照海產品鑒定的依據。

2.4 海產品中標識物含量影響因素

2.4.1 海產品種類與標識物含量

苯丙氨酸經輻照后會產生對酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸，但海產品中本身存在高含量的對酪氨酸（表2），因此經輻照后產生的對酪氨酸與自身所含對酪氨酸相比可忽略不計。因此只對經0.5～50 kGy不同劑量輻照后的海產品中鄰酪氨酸和間酪氨酸含量進行測定。由圖3可知，輻照海產品中鄰酪氨酸和間酪氨酸的濃度隨著接受到的輻照強度的增大而增加，呈現正相關性，但增長的速率因樣品不同而存在差異；相對而言，大管鞭蝦中鄰酪氨酸和間酪氨酸產生速度最快且含量最高，朱珍等[20]采用液相色譜法對輻照水產品中鄰酪氨酸進行了測定，結果顯示大管鞭蝦中鄰酪氨酸含量最高，與表3結果相似。輻照后產生的鄰酪氨酸含量高于間酪氨酸，與報道一致[19]。

圖3 輻照大管鞭蝦（A）、鮐魚（B）和干制魷魚絲（C）中間酪氨酸和鄰酪氨酸含量Fig. 3 Contents of o-tyrosine and m-tyrosine in irradiated S. melantho (A),mackerel (B), and dried squid (C)

2.4.2 輻照劑量與標識物含量

輻照劑量是影響輻照標識物含量主要因素之一，低至0.5 kGy的輻照強度即可使海產品中產生一定含量的鄰酪氨酸和間酪氨酸，繼而判定樣品是否經過輻照；輻照強度與輻照標識物含量呈正相關性，與劉茜等[23]對輻照蛋白質類功能食品的研究一致。但與圖2中針對苯丙氨酸水溶液的輻照結果不同，樣品接受的輻照劑量與輻照標識物無顯著的線性關系，樣品基質的復雜性對輻照標識性產物鄰酪氨酸和間酪氨酸的含量產生了影響。

在相同劑量的輻照下，不同海產品產生的鄰酪氨酸和間酪氨酸濃度不等（大管鞭蝦＞鮐魚＞干制魷魚絲）。對這3 類海產品的成分分析顯示（表2），鮐魚和干制魷魚絲中蛋白質和苯丙氨酸含量均高于紅蝦，但同劑量輻照下鄰酪氨酸和間酪氨酸的含量卻低于紅蝦，因此，海產品中苯丙氨酸質量濃度與其輻照產物鄰酪氨酸和間酪氨酸質量濃度不呈正相關性，海產品均富含苯丙氨酸，其含量不是決定輻照標識物質量濃度的決定因素。

2.4.3 水分與標識物含量

輻照標識物的產生與海產品中水分含量密切相關。紅蝦中的水分質量分數高達81.6%，是本實驗樣品中最高（大管鞭蝦＞鮐魚＞干制魷魚絲），不論在0.5 kGy低強度還是在超過7 kGy高強度（0.5～50 kGy）輻照下紅蝦中產鄰酪氨酸和間酪氨酸的濃度均為最高（大管鞭蝦＞鮐魚＞干制魷魚絲）。酪氨酸同分異構體通過在氧化壓力下羥自由基與苯丙氨酸分子反應形成[30-31]，苯丙氨酸的氧化和酪氨酸同分異構體的產生取決于羥自由基產生的效率，羥自由基由水分子產生，因此樣品中水分含量是影響輻照標識物產生的重要因素。Zhang Jingjing等[17]通過表面增強拉曼散射技術測定苯丙氨酸溶液輻照后產生對酪氨酸、鄰酪氨酸和間酪氨酸3 種同分異構體，且產生的含量與溶液中的羥自由基濃度相關。因此通過對輻照標識物鄰酪氨酸和間酪氨酸含量對海產品所接受輻照劑量的準確測定需根據其不同樣品類別、樣品狀態判定，但可對樣品是否經過輻照進行準確快速的鑒定，避免其他如熱釋光法、光釋光等方法的假陰性及二次輻照的狀況。

2.5 輻照標識物穩定性

2.5.1 貯藏條件的影響

采用0.5、1.0、5.0、7.0、10.0、20.0 kGy對樣品進行輻照分別用PE袋單獨包裝并密封，保存條件分別為冷凍-20 ℃、冷藏4 ℃、常溫20 ℃貯藏，貯藏不同時間后進行測定。圖4顯示：輻照大管鞭蝦未經貯藏及在-20、4 ℃和20 ℃分別貯存90、20 d和7 d后樣品中間酪氨酸和鄰酪氨酸測定結果。在-20 ℃貯存條件下，儲存時間長達90 d時，間酪氨酸和鄰酪氨酸含量與未經貯存的樣品相比略有升高，這可能與長期冷凍條件下，樣品的水分流失有關，但一定程度上表明在此儲存條件下間酪氨酸和鄰酪氨酸較為穩定，受外界因素影響較小。在4 ℃貯存20 d后，間酪氨酸和鄰酪氨酸含量基本保持穩定，只略有下降；在20 ℃貯存7 d后，樣品呈現明顯的腐敗狀態，間酪氨酸和鄰酪氨酸含量下降，但是即使是經0.5 kGy低劑量輻照樣品中仍能檢測到一定含量的間酪氨酸和鄰酪氨酸，并與輻照劑量仍然呈現正相關性。因此，不同貯藏條件不影響對樣品是否經過輻照的判定。

圖4 不同貯存條件下間酪氨酸（A）和鄰酪氨酸（B）的含量變化Fig. 4 Changes in m-tyrosine (A) and o-tyrosine (B) contents at different storage temperatures

2.5.2 加工方式的影響

圖5 不同加工方式后間酪氨酸（A）和鄰酪氨酸（B）含量變化Fig. 5 Changes in m-tyrosine (A) and o-tyrosine (B) contents after different thermal processing treatments

采用海產品加工中常用的3 種加工方式對不同劑量輻照后的樣品進行處理，研究不同加工方式對本研究確立的通過間酪氨酸和鄰酪氨酸作為標識物檢測輻照海產品方法的影響。分別采用漂燙（50 ℃水中5 min）、蒸煮（100 ℃、10 min）及烘烤（115 ℃、8 min）3 種方式對輻照后樣品進行加工處理，與未經加工處理的樣品進行對照，測定間酪氨酸和鄰酪氨酸含量，結果見圖5，輻照后不同的加工方式對樣品中的間酪氨酸和鄰酪氨酸含量具有一定影響，其影響作用最大為烘烤（115 ℃、8 min）的加工方式，對海產品的形態影響較為顯著，其水分快速流失，蛋白質凝固，樣品整體質地變硬，影響間酪氨酸和鄰酪氨酸的提取，對定量檢測產生影響，使檢測到的間酪氨酸和鄰酪氨酸含量下降。蒸煮（100 ℃、10 min）的加工方式也會導致間酪氨酸和鄰酪氨酸損失，蒸煮過程一部分游離氨基酸會溶解到水中，造成游離間酪氨酸和鄰酪氨酸含量減少。影響最小加工方式為漂燙（50 ℃、5 min），對輻照標識物的含量基本無影響。不同加工方式對間酪氨酸和鄰酪氨酸含量的影響存在差異，與海產品經不同方式加工后其形態、水分含量、蛋白質組成等發生不同程度的變化，從而導致間酪氨酸和鄰酪氨酸含量發生變化。

3 結 論

輻照可誘導苯丙氨酸產生酪氨酸的3 種同分異構體即對酪氨酸、間酪氨酸和鄰酪氨酸，且無需其他酶和微生物的作用。在無基質干擾的情況下，輻照劑量與輻照標識物的含量呈線性關系。不同的加工方式對間酪氨酸和鄰酪氨酸輻照特異性標識物的鑒定不產生影響。針對海產品，輻照劑量和水分與輻照標識物產生的含量密切相關。在-20 ℃條件下，間酪氨酸和鄰酪氨酸具有良好的穩定性；不同貯藏條件和加工方式對輻照海產品中輻照標識物酪氨酸的間酪氨酸和鄰酪氨酸含量存在一定影響，但是仍能提取到足夠量的間酪氨酸和鄰酪氨酸用于輻照海產品的鑒定，該方法最低可檢測到經0.5 kGy輻照的樣品。因此，采用QTRAP-UPLC-MS/MS技術，利用其高靈敏度及準確的二次定性特點，對海產品中鄰酪氨酸和間酪氨酸作為輻照標識物進行鑒定，可準確對輻照海產品是否經過輻照進行判定。