超高效液相色譜-串聯質譜法檢測輔助降血脂保健食品中6 種非法添加化學藥物

李曉蕾，陳 軍，楊朝芬，楊 俊

（1.昆明理工大學分析測試研究中心，云南 昆明 650000；2.中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650000）

近年，隨著生活質量的顯著提高，人們對自身健康越來越關注，保健品市場利益空間迅速增加。但是，隨之而來的食品藥品安全問題不斷增多，一些不法分子為獲取高額利益在保健食品中非法添加化學藥物[1-2]，使其功效顯著。此類非法添加隨意性大，劑量不明確，標簽上又未作說明，往往會導致消費者長期、超量服用而引起毒性反應，嚴重的甚至危及生命[3]。

目前，國內外對于保健食品中非法添加化學藥的研究很多[4-9]，但降血脂類化學藥物添加方面的研究尚不夠深入。而近年發病率逐漸上升的高血脂癥等心腦血管疾病，已成為嚴重危害我國人民健康的“隱形殺手”[10-11]，輔助降血脂保健食品市場也呈飛速上升趨勢。已有報道的檢測方法有薄層色譜法[12]和高效液相色譜法[13-14]，但存在選擇性差、定性能力弱和靈敏度低的問題；也有液相色譜-質譜聯用法[15-16]，但檢測成分較少、檢測時間較長。國家食品藥品監督管理局曾于2010年和2017年先后頒布了《輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測方法》[17]、《保健食品中75 種非法添加化學藥物的檢測》[18]、《食品中西布曲明等化合物的測定》[19]，方法中均含有降血脂類化學藥成分的檢測，但檢測成分較少而檢測時間較長，靈敏度也不夠高。因此研究降血脂類化學藥物的檢測方法，對促進質量監督，保障食品安全和人民健康是十分有必要的。

本實驗擬選取6 種臨床上較常用，相對生產成本較低因而價格較低，易于非法添加的降血脂化學藥物，采用超高效液相色譜-串聯質譜法，以多反應監測模式（multi-reaction monitoring，MRM），建立快速、有效地定性、定量檢測輔助降血脂保健食品中6 種非法添加降血脂藥物成分的分析方法，并對20 批市售的輔助降血脂功能保健食品進行檢測，擬為降血脂類保健食品安全監控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輔助降血脂功能保健食品 市售。

對照品：煙酸（批號LF80N66，純度99.5%）、普伐他汀鈉（批號8-XJZ-27-1，純度98.0%）、氟伐他汀鈉（批號7-ABY-122-1，純度98.0%）、美伐他汀（批號2-NYL-167-1，純度98.0%）、洛伐他汀（批號LK10O58，純度98.0%）、辛伐他汀（批號11-SCC-167-1，純度98.0%） 中國食品藥品檢定研究院；實驗用水為超純水；樣品處理所用甲醇為分析純，其他試劑均為質譜純。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC Xevo TQD液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀（配有電噴霧離子源、Masslynx 4.1數據處理系統） 美國Waters公司；Advantage-10/Elix Milli-Q超純水儀 美國Millopore公司；BP211D型電子天平德國Sartorius科學儀器有限公司；KQ-300DA型數控型超聲波提取儀 上海波龍電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0～2.5 min，50% B，2.5～3.0 min，60% B，3.0～3.5 min，100% B，3.5～4.0 min，50% B；流速0.2 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進樣量1 μL[20-22]。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源正離子模式掃描；毛細管電壓2.68 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量850 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣體為氬氣；子離子掃描及MRM模式同時監測[23-24]。經質譜條件優化后，各物質的色譜保留時間、分子離子與特征碎片離子及其采集參數[25]見表1。

表1 6 種降血脂化學藥物的質譜采集參數Table 1 Mass spectroscopic parameters for six antilipemic chemicals

1.3.3 溶液的制備

對照品溶液：分別精密稱取煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀適量（約1～5 mg），置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，定容，搖勻，作為各標準品的標準儲備液。各取單標儲備液適量（0.1～1 mL），置于50 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容配制成混合對照品溶液，使用時進一步稀釋。

供試品溶液：將具有輔助降血脂功效的保健食品每個品種取10～20 粒油狀樣品內容物，混勻；或取10～20 片（丸或袋）固體樣品，置研缽中研磨均勻呈粉末狀。分別精密稱取一次推薦服用量的樣品，置于50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲提取15 min。冷卻至室溫后，用甲醇稀釋定容，搖勻，直接作為供試品溶液，分析時上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣。

陰性樣品溶液：取具有代表性的固體顆粒劑（和信茶）、膠囊劑（油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊）和片劑（阿膠含片）3 種劑型共4 種陰性樣品，分別精密稱取一次推薦服用量樣品置于50 mL容量瓶，與供試品溶液同法制成陰性樣品溶液。

2 結果與分析

2.1 6 種化學藥物的色譜及質譜特性

色譜-質譜條件的優化：實驗對流動相的組成（甲醇-水、甲醇-甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-甲酸溶液）、流速（0.1、0.2、0.4 mL/min）和柱溫（20、30、40 ℃）等條件分別進行考察。對流動相的考察發現，甲醇-水體系較乙腈-水體系分析時間長，峰形差，因此選用乙腈-水體系，而乙腈-水體系在水中添加0.1%的甲酸后峰形更好，因此選用0.1%甲酸-乙腈溶液做流動相。在流速為0.4 mL/min或溫度為40 ℃時，由于煙酸、普伐他汀鈉和洛伐他汀、辛伐他汀2 組成分的保留時間比較接近，不能很好地達到基線分離，而流速低（0.1 mL/min）或溫度低（20 ℃）均會導致分析時間延長，故最終確定0.2 mL/min，柱溫30 ℃為實驗最佳條件。優化得到的最佳色譜條件可在4 min內高分離度、快速有效地分離6 種化學藥物，均優于國家食品藥品監督管理局發布的檢測方法[17-19]及相關文獻[21-24]方法。質譜部分在正離子、MRM模式下，用1 μg/mL的混合標準溶液手動調諧結合自動調諧，逐一選擇并確定適合各化合物的準離子峰及母離子，采用子離子掃描方式進行二級質譜分析，對子離子進行優化選擇，找出滿足化合物碎裂規律的子離子，確定定量與定性離子，同時優化毛細管電壓和錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數，使離子強度最大、分離度最佳。最后確定測定6 種化學藥物的定性和定量離子對，共12 個離子檢測通道。各化合物采集的總離子流見圖1，定量離子對的MRM離子流見圖2。

圖1 6 種降血脂類化學藥物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of six antilipemic drugs

圖2 6 種降血脂化學藥對照品定量離子對的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of quantitative ions of 6 antilipemic drug standards

2.2 基質效應考察結果

本實驗選取具有代表性的4 種陰性樣品基質：固體顆粒劑（和信茶）、膠囊劑（油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊）和片劑（阿膠含片）進行基質效應考察。基質效應根據基質空白配制標樣響應值與同質量濃度溶劑標樣響應值的比值進行評價[26-27]，大于1時為基質增強效應，小于1時為基質抑制效應。對于基質效應過強的樣品，應采取相應的處理手段以減小其對測定的干擾。從實驗結果可以看出，基質對煙酸、普伐他汀鈉表現出基質增強效應，而對氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀表現出基質抑制效應。本實驗考察的基質效應在0.82～1.18之間，表明樣品基質對目標成分響應干擾相對較小。

樣品處理過程中，大部分基質較簡單，前處理時采用甲醇超聲提取過濾后即上樣分析。但個別樣品（如苦瓜洋參軟膠囊和蒼芎膠囊）基質相對比較復雜，對出峰時間較早的煙酸和普伐他汀鈉基質增強效應大于1.3，影響數據正確性，且易污染質譜檢測器離子源，故先將樣品過WAX固相萃取柱凈化處理后再上機分析[28]。苦瓜洋參軟膠囊和蒼芎膠囊凈化后基質效應降至1.12和1.15，但凈化后回收率降低至70.2%和65.4%，因此在基質影響相對較小的情況下并未對所有樣品進行凈化處理。

2.3 方法專屬性考察結果

取具有代表性的固體顆粒劑（和信茶）、膠囊劑（油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊）和片劑（阿膠含片）3 種劑型共4 種陰性樣品，按陰性樣品溶液的制備方法處理后，依1.3.1節方法進樣，按1.3.2節方法采集圖譜，得到陰性樣品的MRM離子流色譜圖，12 個離子通道中均未見有干擾6 種目標物的色譜峰。結果表明，具有代表性的4 種陰性樣品對所測6 種目標物均無干擾，方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察與檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）測定結果

取混合對照品溶液，按1.3.1節和1.3.2節方法進樣測定，以各組分定量離子對的峰面積（Y）對質量濃度（X）繪制標準曲線，得回歸方程和相關系數（R2），見表2。結果表明，6 種化學藥物的線性關系在線性范圍內良好，R2均在0.995 5以上。取陰性樣品和信茶適量，置于50 mL容量瓶中，按1.0 mg/g的添加量加入混合對照品溶液，按供試品溶液同法經逐步稀釋后進樣，以3 倍信噪比時計算各化學藥的LOD，為10 倍信噪比時計算各化學藥的LOQ，其中洛伐他汀、美伐他汀和辛伐他汀的LOD降低至國家食品藥品監督管理局發布檢測方法[18]的12.5%以下。結果表明方法LOD均在4～39 μg/kg之間，說明方法具有較高的靈敏度。

表2 6 種降血脂化學藥的線性方程、相關系數、回收率及LOD、LOQTable 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs, and LOQs for six antilipemic drugs

2.5 進樣精密度實驗結果

取混合對照品溶液1 μL，按1.3.1節和1.3.2節色譜、質譜條件進樣測定，連續測定6 次，計算煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀定量離子對質譜峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.16%、5.20%、2.26%、3.88%、2.12%、6.86%，均在7%以內，表明方法的精密度良好。

2.6 重復性實驗結果

精密稱取三七膠囊陰性樣品6 份，每份為1 次日常服用量，分別精密加入對照品儲備液適量，使含各種化學藥含量均為1.0 mg/kg，按1.3.3節方法制成供試品溶液進樣測定，計算各成分含量及其RSD。結果煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀的含量分別為0.97、0.99、1.02、1.01、0.95、0.96 mg/kg；RSD分別為2.46%、2.49%、3.14%、1.86%、1.50%、1.57%，表明該方法重復性較好。

2.7 溶液穩定性實驗結果

取供試品溶液1 份，在配制后避光冷藏放置0、2、4、6、8、12 h。根據6 種化學藥的定量離子對峰面積計算其RSD分別為2.83%、1.75%、4.29%、2.58%、5.61%、1.87%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 加標回收率實驗結果

表3 3 種不同基質陰性樣品中6 種降血脂化學藥的加標回收率結果Table 3 Recoveries of six antilipemic drugs in three different spiked matrixes

續表3

精密稱取陰性樣品和信茶、三七膠囊、阿膠含片各9 份，每份為1 次日常服用量，分為3 組，按1.3.3節方法制備成陰性樣品溶液，分別進行定量限1、2、10 倍（0.1、0.2、1.0 mg/kg）3 個添加水平的回收率實驗，結果見表3。6 種化學藥物的加樣平均回收率均在80.2%～106.1%之間。

2.9 樣品測定

本實驗共收集輔助降血脂類功能性保健食品20 批，取各樣品按1.3.3節方法制備供試品溶液，按1.3.1節和1.3.2節色譜、質譜條件進樣測定，根據定量監測離子對的色譜峰面積，采用外標法計算樣品中各化學藥物成分的含量。結果發現，20 批輔助降血脂類保健食品中共檢出3 批可能添加化學藥物，分別檢測出煙酸和洛伐他汀，含量分別為煙酸81.2、72.7 μg/g，洛伐他汀690 μg/g。

3 結 論

本實驗建立輔助降血脂類保健食品中6 種非法添加降血脂化學藥物（煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀）的超高效液相色譜-串聯質譜法，具有快速、準確、靈敏度高和專屬性強等優點，可為藥品監管及規范保健品市場提供理論依據。對于如何杜絕保健食品非法添加的情況，建議一方面大力發展更先進靈敏的檢測技術，另一方面也需建立和完善非法添加有害化學成分的各種譜庫信息，以利于對有害物進行篩查[29-30]，此外，從多方面加強監管以及增加懲罰力度也十分重要。