白藜蘆醇對中性粒細胞性哮喘小鼠肺組織炎癥的抑制作用及其機制

冉 琴，張 雷，張 沄，邱玉環，袁謝芳，王孝蕓，唐紅梅，王 星，李國平

(1. 西南醫科大學附屬醫院呼吸內科，四川 瀘州 646000； 2.西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，四川 瀘州 646000)

根據發病機制哮喘可分為輔助性T淋巴細胞2(T-helper lymphocyte type-2, Th2)型和非Th2型，相應的氣道炎癥也存在著不同的亞型[1]，在非Th2型重癥哮喘患者中發現炎癥細胞以中性粒細胞為主。然而，中性粒細胞性哮喘與哮喘的急性發作、控制不佳和重癥哮喘等有關，并且對激素的治療效果欠佳，甚至出現“激素抵抗”反應[2-3]。目前，如何有效治療中性粒細胞性哮喘是臨床急需解決的重要難題，因此尋找新的藥物用于治療中性粒細胞性哮喘具有重要意義。白藜蘆醇是多酚類化合物，存在于多種植物中[4]，具有多種生物活性，其是公認的具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用和癌癥化學預防劑[5-6]。研究[7]表明：在人群中觀察到白藜蘆醇攝入與肺功能成正相關關系，即攝入白藜蘆醇可以增加用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的水平。越來越多的證據[8-9]表明：白藜蘆醇對呼吸系統疾病有保護作用，如急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺纖維化等肺部疾病。然而，國內外至今尚無白藜蘆醇改善中性粒細胞性哮喘氣道炎癥的研究報道。本研究擬通過建立中性粒細胞性哮喘模型，探討白藜蘆醇對中性粒細胞性哮喘的作用及其可能的作用機制，為臨床上治療中性粒細胞性哮喘尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 24只無特殊病原體(specific pathogen free, SPF)級C57BL/6J雌性小鼠購自重慶騰鑫科技公司，周齡6～8周，體質量18～22 g，動物合格證號：SCXK(京)2016-0002。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、卵白蛋白(ovalbumin, OVA)、白藜蘆醇(resveratrol, Res)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)均購自美國Sigma公司， 白細胞介素17(interleukin-17, IL-17)檢測試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司，丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購自南京建成生物科技研究所，BCA蛋白分析試劑盒和活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。小鼠肺功能儀購自美國 Buxco公司，全光譜分光光度計購自德國Thermo公司，離心機購自北京白洋醫療器械有限公司，低溫超速離心機購自德國 Eppendorf公司，正置熒光顯微鏡購自日本 Olympus公司，光學顯微鏡病理圖像分析儀購自德國Leica公司，低溫恒溫水浴槽購自上海恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗動物分組 選取18只C57BL/6J雌鼠作為實驗組構建制備中性粒細胞性哮喘模型，再隨機分為3組： LPS+OVA組、Res組和NAC組，每組6只。同時選取6只同周齡C57雌鼠作為對照組(PBS組)。Res組小鼠于激發前2 h灌胃給予30 mg·kg-1白藜蘆醇，NAC組小鼠于激發前2 h灌胃給予3 mg·kg-1NAC，LPS+OVA組和PBS組僅給予等體積生理鹽水，各組小鼠給藥體積均為0.2 mL。所有小鼠造模前均在相通環境(12 h/12 h 明暗周期，60%～70%濕度及飲水飲食可自由獲取)下飼養1周。

1.3 中性粒細胞性哮喘小鼠模型的建立 中性粒細胞性哮喘造模方法參照文獻[10]。采用腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)麻醉小鼠，于實驗開始的第0、1、2、7和14天用LPS (10 μg) 滴鼻聯合OVA (75 μg) 腹腔注射致敏實驗組小鼠，PBS組小鼠致敏藥物用生理鹽水代替，方法及劑量同實驗組。于實驗的第15天起，實驗組小鼠于麻醉狀態下鼻腔滴入0.1% OVA溶液50 μL，每天1次，連續激發7 d，PBS組給予等體積生理鹽水滴鼻。末次激發后24 h檢測小鼠氣道阻力，48 h處死小鼠。

1.4 小鼠氣道阻力檢測 最后一次滴鼻激發小鼠后24 h，即第22天用乙酰甲膽堿依次按0、6.25、12.50、25.00和50.00 g·L-1遞增的濃度霧化小鼠，并采用肺功能儀對小鼠進行氣道阻力的測定，每個濃度下的反應時間為3 min，取每個濃度反應期間的增強呼氣間歇(enhanced pause,Penh)均值作為評價氣道高反應(airway hyperresponsiveness, AHR)的指標。

1.5 小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的收集及檢測 于實驗第23 天行腹腔注射致死劑量戊巴比妥鈉處死小鼠并分離氣道，22G留置針氣管插管并固定，結扎主支氣管，0.8 mL PBS灌洗肺3次(回收率≥80%時為合格)，收集BALF，1 500 r·min-1、4℃離心10 min。取上清-80℃保存，溶液激用于ELISA檢測。用1 mL PBS重懸細胞，于光學顯微鏡下進行細胞總數和炎癥細胞分類計數。

1.6 小鼠肺組織病理切片HE染色 取左肺組織，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋后行HE染色，于光學顯微鏡下觀察肺組織中的炎癥情況，并采用HE染色切片半定量方法評定支氣管周圍炎癥細胞浸潤程度[11]。評分標準：無炎癥細胞(0分)；少許炎癥細胞(1分)；較多分布不均的炎癥細胞(2分)；大量炎癥細胞，分布較均勻，少見聚集成團(3分)；大量炎癥細胞聚集成團(4分)。

1.7 小鼠肺組織中ROS和MDA水平檢測 取出右肺組織，將一葉肺包埋行冰凍切片(切片厚度為4 μm)，按試劑盒說明書中步驟進行ROS檢測，于熒光顯微鏡下觀察肺組織內的熒光強度。將剩余肺組織于冰上進行手工勻漿：先取組織塊在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，準確稱質量，放入5 mL勻漿管中，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質，后按試劑盒說明書進行操作，用全光譜分光光度計進行MDA的測定。

2 結 果

2.1 各組小鼠吸入不同濃度乙酰甲膽后的氣道阻力 與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠在霧化期間出現呼吸急促和打噴嚏等表現，且各濃度下的Penh值均明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠的哮喘癥狀明顯改善，各濃度下的Penh值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠吸入不同濃度乙酰甲膽堿后Penh值

Tab.1 Penh values of mice after inhalation of methacholine at different concentrations in various groups (n=6,±s)

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBS group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with LPS+OVA group.

2.2 各組小鼠BALF中細胞總數和炎癥細胞分類計數 與PBS組比較，LPS+OVA組BALF中細胞總數(total cells, TC)、中性粒細胞(neutrophil, NEU)數和嗜酸性粒細胞(eosnophils, EOS)均明顯增加(P<0.01)。與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組BALF中TC、NEU和EOS明顯減少(P<0.05或P<0.01)。各組小鼠BALF中炎癥細胞均以中性粒細胞為主。見表2。

表2 各組小鼠BALF中細胞總數和炎癥細胞分類計數

Tab.2 Total number of cells and inflammatory cell classification and count in BALF of mice in various groups (n=6,±s)

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBS group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with LPS+OVA group.

2.3 HE染色觀察各組小鼠肺組織形態及炎癥表現 PBS組小鼠氣道上皮細胞排列整齊，周圍無或少量炎癥細胞，肺泡壁結構完整，肺泡內無或存在少許炎癥細胞；LPS+OVA組小鼠氣道上皮明顯增厚，氣道周圍存在大量聚集成團的炎癥細胞，肺泡壁結構大量破壞，肺泡內存在大量炎癥細胞浸潤；Res組和NAC組小鼠氣道上皮增厚較LPS+OVA組明顯減弱，肺泡壁結構破壞明顯減少，氣道周圍和肺泡內炎癥細胞浸潤明顯減少。見圖1(插頁一)。與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠肺組織炎癥評分明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠肺組織炎癥評分明顯降低，但明顯高于PBS組(P<0.01)。各組小鼠肺組織炎癥評分見表3。

2.4 ELISA法檢測各組小鼠BALF上清中IL-17水平 與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠BALF上清中IL-17水平明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組BALF上清中IL-17水平明顯降低，但高于PBS組(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠肺組織炎癥評分和BALF上清中IL-17水平

Tab.3 Inflammation scores of lung tissue and IL-17 levels in BALF supernatant of mice in various groups (n=6,±s)

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBS group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with LPS+OVA group.

2.5 各組小鼠肺組織中ROS水平 與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠氣道及肺泡中ROS熒光強度明顯增強；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠氣道及肺泡中ROS熒光強度明顯減弱。見圖2(插頁一)。

2.6 各組小鼠肺勻漿中MDA水平 PBS組小鼠肺勻漿中MDA水平為(1.66±0.10)μmol·mg-1，LPS+OVA組小鼠肺勻漿中MDA水平為(3.90±0.23)μmol·g-1，與PBS組比較，LPS+OVA組肺勻漿中MDA水平明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較， Res組小鼠肺勻漿中MDA水平[2.77±0.07)μmol·g-1]和NAC組小鼠肺勻漿中MDA水平[(2.39±0.09)μmol·g-1]明顯降低(P<0.01)，但較PBS組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

3 討 論

白藜蘆醇主要來源于花生、紅葡萄酒、虎杖和桑葚等植物。許多研究[12-13]已證實：白藜蘆醇具有不同的生物學效應，其最主要的生物作用是抗氧化、抗炎、雌激素作用、抗癌以及癌癥化學預防活性。在腫瘤、動脈粥樣硬化和心腦血管疾病等方面白藜蘆醇已得到廣泛應用，目前也將其應用于呼吸系統疾病的研究。研究[14-15]表明：白藜蘆醇對支氣管哮喘具有治療作用，其機制可能與抑制哮喘的炎癥反應有關。本研究采用白藜蘆醇干預中性粒細胞性哮喘具有一定的可行性。

本研究結果表明：白藜蘆醇對中性粒細胞性哮喘小鼠肺組織損傷具有保護作用，主要表現：①降低小鼠AHR和BALF中的炎癥細胞及上清中細胞因子；②減輕肺組織的炎癥反應；③降低肺組織內氧化應激水平。本研究中小鼠肺組織HE染色顯示：白藜蘆醇可明顯降低肺組織氣道及肺泡炎癥，改善氣道壁增厚。同時，為了進一步探討白藜蘆醇對中性粒細胞性哮喘小鼠肺組織炎癥的影響，本研究分析了小鼠氣道炎癥指標(AHR、炎癥細胞計數和IL-17)，其中IL-17 為Th17細胞分泌的一種細胞因子，認為其為中性粒細胞浸潤的一個觸發者[16]，因此測定IL-17的水平可以反映組織的炎癥浸潤程度。本研究結果顯示：與LPS+OVA組比較，Res組小鼠AHR、炎癥細胞和IL-17均明顯降低，表明白藜蘆醇可減輕中性粒細胞性哮喘小鼠肺組織的炎癥反應。

ROS是外源性氧化劑或細胞內有氧代謝過程中產生的具有很高生物活性的含氧合物的總稱，在調控細胞生物學行為中起到重要作用[17]。氧化應激是哮喘炎癥發生發展的重要機制之一，ROS與多種細胞信號傳導級聯有關，是導致呼吸道炎癥的重要介質[18]。多項研究[18-21]表明：吸入不同的變應原均可促進細胞內ROS的產生，在動物模型中過量的ROS產生還可引起AHR、組織損傷和重塑，因此抑制體內ROS反應具有重要意義。MDA是脂質過氧化產物，由多不飽和脂肪酸(PUFA)通過化學反應和酶催化反應產生，為硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)的原型，常作為氧化應激的生物標記，即脂質過氧化[22]。白藜蘆醇具有抗氧化作用，本文作者推測：白藜蘆醇可以通過抗氧化作用抑制中性粒細胞性哮喘的炎癥反應。ROS和MDA均可反應組織內氧化應激水平，本研究結果顯示：與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠肺內ROS和MDA表達水平升高，提示該組小鼠體內氧化應激反應強烈；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠肺內ROS和MDA水平明顯降低，提示白藜蘆醇可以通過抗氧化作用抑制小鼠體內氧化應激反應來發揮保護作用。

綜上所述，白藜蘆醇對中性粒細胞性哮喘小鼠肺組織的炎癥反應具有抑制作用，其機制可能與抑制體內的氧化應激有關，但具體的作用通路還有待進一步研究。