優化蓽茇多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究＊

馬 嵐，王慧敏，陳建平，成日青，齊和日瑪，郭慧卿，塔 娜

（內蒙古醫科大學 呼和浩特 010110）

蓽茇（piper Longum L）是胡椒科胡椒屬植物，其干燥成熟的果穗可入藥[1]，是中、蒙、藏、維醫的習慣用藥，具有調理胃火、祛“巴達干·赫依”、調節體素、滋補強壯、平喘、祛痰、止痛之功效[2-3]?，F代藥理學研究表明，蓽茇具有抗癌、保肝、抗氧化、抗炎、免疫調節、擴張冠狀動脈血管、抗菌、抗血小板、抗高血脂、保護心肌、抗抑郁等藥理學作用[4]。蓽茇中含有多糖類物質，大量的藥理和臨床研究表明，有些植物多糖具有獨特的藥理及生物活性，比如提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等，并具有無毒、副作用小等優點[5-6]。所以中蒙藥中多糖的研究不僅成為熱門領域，也成為當今中蒙藥的研發方向之一[7]。

基于多糖的這些優點，本文采用苯酚－硫酸法測定蓽茇多糖（Piper Longum Polysaccharides，PLP）的含量，通過考察提取溫度、提取時間、提取次數等影響因素對PLP的提取工藝進行地研究，并采用正交試驗法優化提取工藝，最終確定最佳工藝條件，通過ABTS、DPPH自由基清除實驗，對PLP的抗氧化活性進行初步研究，為今后開發蓽茇多糖天然抗氧化劑奠定基礎。

1 實驗儀器及材料

1.1 實驗儀器

DR6000紫外分光光度計（美國哈希公司）；旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）；ZKB-1-4型循環水多用真空泵（鞏義市英峪儀器廠）；BFX5—320型低速自動平衡離心機（白洋離心機廠）；KH-250DB型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；恒溫水浴箱（北京市長風儀器儀表）；恒溫鼓風干燥箱（福利達實驗儀器廠）；BSA124S分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；

1.2 材料與試劑

蓽茇（購自呼和浩特市天力藥業，產地：廣西，經內蒙古醫科大學藥學院藥用植物學教研室喬俊纏教授鑒定為胡椒科植物蓽茇的干燥成熟果穗），ABTS[2,2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽]、DPPH（2,2-聯苯基-1-苦基肼基）、D-無水葡萄糖標準品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號：110833-201506）、乙醇（95%）、無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀、抗壞血酸（VC）、苯酚、濃硫酸、溴化鉀、活性炭等均為分析純。

2 方法

2.1 PLP的制備

稱取蒙藥蓽茇5.0 g，加入100 ml 95%乙醇加熱回流60 min后過濾，除去脂溶性物質及色素，將殘渣揮干，然后倒入圓底燒瓶中加入150 ml蒸餾水加熱回流提取60 min[8]，趁熱將提取液進行抽濾，依上述方法重復提取一次，然后將兩次提取液旋蒸濃縮約至20 ml，按1∶2比例加入40 ml乙醇溶液（95%），靜置24小時。然后抽濾，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌沉淀。將沉淀揮干，用蒸餾水溶解并定容至100 ml容量瓶中。吸取上述溶液10 ml，置于100 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。

2.2 PLP的含量測定

2.2.1 測定波長的選擇

精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0 ml供試品溶液1.0 ml分別置于試管中，用蒸餾水定容至2.0 ml，加入5%苯酚溶液1.0 ml，濃硫酸5.0 ml，于40℃水浴中反應30 min后置于冷水中冷卻，在400-800 nm進行波長掃描，吸收光譜顯示對照品和供試品分別在491 nm和490 nm處有最大吸收，故選擇490 nm作為測定波長。

2.2.2 苯酚-硫酸法顯色反應的探索

空白液的制備：精密吸取2.0 ml蒸餾水，加入0.5 ml的5%苯酚和5.0 ml濃硫酸，置于具塞比色管中。

供試品液的制備：精密吸取1.0 ml蒸餾水，1.0 ml供試液，分別吸取5%苯酚溶液 0.5、1.0、1.5、2.0 ml，5.0 ml濃硫酸，分別置于試管中。

將上述溶液于40℃水浴中反應30 min后置于冷水中冷卻，490 nm波長處測定其吸光度。吸光度分別為：

依上述結果可知，當加入的苯酚體積為1.5 ml時吸光度最大，所以確定后續的苯酚-硫酸顯色法所加入的5%苯酚溶液的體積為1.5 ml。

2.2.3 標準曲線的繪制

采用苯酚—硫酸法測定PLP的含量，葡萄糖標準曲線繪制如下：

表1 蓽茇供試品的濃度及其吸光度

表2 精密度實驗結果

表3 重復性實驗結果

分別精密量取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml置具塞比色管中，用蒸餾水稀釋至2.0 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml，濃硫酸5.0 ml，于40℃水浴中反應30 min顯色后置于冷水中冷卻，采用紫外—可見分光光度計在490 nm處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，以溶液濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗

吸取適量供試品溶液，按2.32項下方法操作顯色，于490 nm處連續取樣測定吸光度5次，其RSD值為0.23%，表明該方法精密度良好（表2）。

2.3.2 重復性實驗

精密稱取蒙藥蓽茇5.0 g，分別制備5份供試品溶液，分別按2.2.3項下方法操作顯色，于490 nm處測定吸光度，其RSD值為0.84%，表明該方法重復性良好（表3）。

2.3.3 穩定性實驗

吸取適量供試品溶液，按2.2.3項下方法操作顯色，自加水定容搖勻開始計時，分別于10、20、30、45、60 min取樣測定吸光度，結果見表4。與計時10min后的數據比較，60 min后吸光度下降了0.33%，表明供試品溶液在60 min內穩定性較好。

2.3.4 加樣回收率實驗

精密稱取蓽茇5.0 g，共9份，分別加入19.9 mg、28.4 mg、36.9 mg的葡萄糖對照品各三份，按2.2制備多糖溶液，按2.2.3項顯色方法操作測定總多糖含量，結果平均加樣回收率為98.8%，RSD值為1.10%，表明該測定方法可靠，結果見表5。

表4 穩定性實驗結果

表5 加樣回收率實驗結果

2.4 PLP的提取工藝研究

以多糖提取率為指標，首先通過單因素試驗考察提取溫度、提取時間和提取次數對PLP提取率的影響，然后根據以上單因素試驗，選取各因素中較優的3個水平，采用L9（33）正交表進行正交試驗設計，從而選出蓽茇多糖提取的最佳工藝條件。

2.5 單因素試驗

2.5.1 提取溫度對PLP提取率的影響

稱取蓽茇5 g，在提取時間為60 min，提取次數為2次的條件下，設置提取溫度分別為 60、70、80、90、100℃，按照2.1的步驟進行多糖的提取，然后在波長490 nm處測定多糖溶液的吸光度，根據回歸方程計算多糖溶液的濃度，得出蓽茇多糖的提取率。

2.5.2 提取時間對PLP提取率的影響

稱取蓽茇5 g，在提取溫度為100℃、提取次數為2次的條件下，設置提取時間分別為 40、60、80、100、120 min，按照2.1的步驟進行多糖的提取，然后在波長490 nm處測定多糖溶液的吸光度，根據回歸方程計算多糖溶液的濃度，得出蓽茇多糖的提取率。

2.5.3 提取次數對PLP提取率的影響

稱取蓽茇5 g，在提取溫度為100℃、提取時間為60 min的條件下，分別提取1、2、3、4、5次，按照2.1的步驟進行多糖的提取，然后在波長490 nm處測定多糖溶液的吸光度，根據回歸方程計算多糖溶液的濃度，得出蓽茇多糖的提取率。

2.6 正交試驗

以單因素試驗的結果為基礎，采用L9（33）正交表進行正交試驗設計，考察提取溫度（A）、提取時間（B）和提取次數（C）三個因素，選取各因素中較優的3個水平。

2.7 PLP脫蛋白

蓽茇多糖濃縮溶液采用Sevage法[9]去除蛋白質、核酸等雜質，常溫下離心10 min，然后取上清液重復操作5次，直到用紫外檢測在波長260-280 nm處無明顯吸收峰為止[10]。最后，將脫蛋白后的多糖溶液按照1∶2的比例加入乙醇溶液（95%），靜置24小時，抽濾，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌沉淀，烘干后得到初步純化的蓽茇多糖，即脫蛋白后的PLP。

2.8 抗氧化活性研究

許多中蒙藥多糖均具有抗氧化活性，可以增強免疫功能并延緩機體衰老[11]，機體內自由基具有很強的氧化反應能力，可與大多數的無機物和有機物發生多種類型的反應，致細胞突變并壞死，因此多糖的清除自由基能力是評價其抗氧化活性的一個重要方面[12-14]。

2.8.1 ABTS自由基清除試驗

ABTS溶解在0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.4）配成7.4 mmol/L的溶液，然后取2 ml上述ABTS溶液與2 ml的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，將混合物放在室溫下黑暗中16 h。稀釋ABTS溶液使其吸光度控制在0.7±0.02的范圍內（734 nm處測吸光度）并且在30℃恒溫30 min[15]，每個樣品取2 ml（濃度分別為0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/ml）與2mlABTS溶液混合，在室溫下反應20 min，立即在734 nm處測吸光度并記錄。每個樣品重復測3次并求平均值，VC用做標準，。按照下列公式分別計算蓽茇多糖與VC對ABTS自由基的清除率，公式如下：

ABTS自由基的清除率（%）={1-（A2-A1）/A0}×100%

式中，A0為2 ml ABTS溶液+2 ml蒸餾水的吸光度值；A1為2 ml磷酸緩沖溶液+2 ml蓽茇多糖溶液吸光度值；A2為2 ml ABTS溶液+2 ml蓽茇多糖溶液吸光度值。

2.8.2 DPPH自由基清除試驗

DPPH：用95%乙醇配置成0.2 mmol/L的溶液。

每個樣品取 2 ml(濃度分別為 0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/ml)與2 ml DPPH溶液混合，室溫下混合30 min，吸光度在517 nm處測量，VC用做標準，每個樣品重復測3次并求平均值。按照下列公式分別計算蓽茇多糖與VC對DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基的清除率（%）={1-（A2-A1）/A0}×100%

式中，A0為2 ml DPPH溶液+2 ml蒸餾水的吸光度值；A1為2 ml乙醇+2 ml蓽茇多糖溶液吸光度值；A2為2 ml DPPH溶液+2ml蓽茇多糖溶液吸光度值[16]。

3 結果與分析

3.1 PLP含量的測定

葡萄糖標準曲線的回歸方程為A=10.366C+0.011（n=6，r=0.9996），式中C為葡萄糖標準溶液的濃度，A為葡萄糖在490 nm波長處測定的吸光值。結果顯示葡萄糖溶液濃度在0.0100-0.0602 mg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。

3.2 單因素試驗結果分析

蓽茇多糖的提取率隨提取時間的增長而增大，提取時間小于60 min時提取率增幅緩慢，大于60 min增幅明顯，為了更準確地考察提取時間對PLP提取率的影響，在正交試驗中選擇提取時間分別為80、100、120 min作為考察水平進行進一步優化。

蓽茇多糖的提取率隨溫度的升高而增大，在提取溫度為100℃時，提取率最高；溫度從60℃增至70℃時，多糖的提取率沒有明顯提高，但溫度大于70℃提取率明顯提高很多，結果表明溫度對多糖的提取率影響較大，所以選擇提取溫度分別為80、90、100℃作為考察水平進行正交試驗。

蓽茇多糖的提取率隨提取次數的增加而增大，當提取次數大于4時，多糖提取接近完全，當提取次數增加到5時，提取率變化不大，增加趨勢減緩，從經濟角度綜合考慮，選擇提取次數分別為2、3、4次作為考察水平進行正交試驗。

3.3 正交試驗結果分析

3.3.1 正交試驗結果

為了確定PLP的最佳工藝條件，根據以上單因素試驗，采用L9（33）正交表，以提取時間，提取溫度，提取次數三個因素，選取各因素中較優的3個水平，見表6。

提取時間（80、100、120）分鐘，提取溫度（80、90、100）℃，提取次數（2、3、4）次，做正交試驗。見表7和表8。

圖1 葡萄糖標準曲線

表6 L9（33）因素水平表

表7 正交試驗設計表及結果

表8 方差分析

由正交試驗結果（表7）可知，影響蓽茇多糖提取率的諸因素的主次關系依次是提取溫度（B），提取時間（A），提取次數（C）；從表7可以直觀的辨別各因素的最佳組合為A3B3C2，即最佳工藝為提取時間120分鐘，提取溫度100℃，提取次數3次。

3.3.2 驗證試驗

在最佳工藝條件下進行蓽茇多糖提取的驗證試驗，結果見下表：

表9 蓽茇中多糖含量的測定結果

圖2 PLP與VC對ABTS自由基清除率

圖3 PLP與VC對DPPH自由基清除率

如表9所示，采用最佳提取方法提取蓽茇多糖，粗多糖平均提取率為1.21%，而且RSD值僅為1.7%，三次結果差異很小，說明該工藝穩定可行。

3.4 脫蛋白后PLP對ABTS自由基的清除結果

如圖2所示，蓽茇多糖濃度在0.06mg?ml-1時，對ABTS自由基的清除率較低為31.12%，隨著多糖濃度升高，對ABTS自由基清除率也增大，當多糖濃度大于0.48mg?ml-1時，清除率已達99.71%，多糖濃度繼續升高，對ABTS自由基的清除率增加得不再明顯，說明抗氧化作用已經接近飽和，當多糖濃度為0.96mg?ml-1時，其清除率與VC清除率相同，達到100%。當多糖濃度增加至1.92mg?ml-1時，其清除率略有下降為99.42%。

3.5 脫蛋白后PLP對DPPH自由基的清除結果

如圖3所示，蓽茇多糖對DPPH自由基清除率隨多糖濃度先升高后下降，當濃度達到0.48mg?ml-1時，清除率最大達到88.27%，接近VC的清除率。但是當多糖濃度增至0.96mg?ml-1時，對DPPH自由基的清除率反而降至37.14%，說明由于多糖不溶于乙醇，同時多糖濃度過高，出現多糖析出的現象，導致清除率有所下降。

4 結論

本研究采用正交試驗法優化PLP的提取工藝條件，驗證試驗結果表明，該提取工藝條件穩定可靠，可以為PLP的進一步開發和藥理作用研究奠定實驗基礎。體外抗氧化實驗表明，PLP對ABTS自由基的清除能力較高，當PLP濃度不低于0.96 mg/ml時，其清除率與VC清除率相同，而對DPPH自由基的清除能力當PLP濃度超過0.96mg/ml時弱于Vc。總的來說，PLP對于自由基還是具備較好的清除能力，具有良好的抗氧化活性，今后會針對PLP抗氧化活性進行進一步體內研究。