IRE1α-XBP1通過上調IL-6表達促進黑色素瘤細胞增殖的分子機制

陳 誠 張學軍

(復旦大學附屬中山醫院整形外科 上海 200032)

黑色素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤,目前尚無有效的藥物治療手段[1]。黑色素瘤侵襲性很強[2],細胞和分子機制仍未完全闡明[3]。黑色素瘤具有缺乏血供和高增殖特性,極易因微環境的改變而出現應激,如低氧、營養缺乏和酸堿度改變。這些應激將導致腫瘤細胞內大量蛋白質的折疊和修飾出現錯誤,致使這些蛋白質沉積在內質網管腔內,導致內質網應激,進而誘發未折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR)[4-6]。UPR又反饋性使細胞大量合成蛋白質(以分泌型蛋白質為主),重建內質網穩態。因此,UPR與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移密不可分。

哺乳動物細胞體內存在3種UPR途徑,分別由活化因子6 (activating factor 6,ATF6)、肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶樣ER激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase,ERPERK)介導。其中IRE1途徑是3種URP途徑中進化最保守的。IRE1是雙官能團單跨膜蛋白質,包括管腔區域,連接區域,激酶區和核糖核酸內切酶區。其中管腔區域存在于內質網內腔,能夠感受未折疊蛋白質的堆積,激活感受器。激酶和內切酶區激活后,可以非傳統方式剪接下游轉錄調控因子XBP1(X-box binding protein 1)的26 nt內含子片段,使之發生框架移碼,轉錄出具有活性的XBP1s[7]。

大量的研究已表明UPR可在多種實體腫瘤中被激活[8-9]。但IRE1-XBP1通路在黑色素瘤中的表達和作用尚不明確,本研究擬通過臨床樣本及體內外實驗闡明IRE1-XBP1信號通路在黑色素瘤細胞增殖中的作用。

資 料 和 方 法

患者信息收集2015年3月至2016年12月復旦大學附屬中山醫院收治的、經病理檢查明確的黑色素瘤患者61例,平均年齡為57.9歲(30～85歲),其中男性36例,女性25例,原發灶部位為頭面部的3例,軀干部12例,四肢46例,所有患者均無淋巴結及遠處轉移。

細胞培養黑色素細胞系(HEMn-MP和HEMn-DP)和黑色素瘤細胞系(Mel-RMu、MM200、Mel-CV、IgR3、A2058和SkMel-28)均購自中國科學院上海細胞庫。培養體系采用DMEM高糖培養基加10%胎牛血清(Gibco,美國Thermo Fisher公司)。

細胞增殖檢測96孔板鋪板,每孔1×103個細胞與CCK8試劑在37 ℃孵育,不同時間點檢測450 nm處的熒光強度。采用BrdU檢測試劑盒(編號6813,美國Cell Signaling公司),按照說明書進行細胞增殖檢測。

免疫組化4%甲醛水溶液包被的組織切片行免疫組化染色,檢測XBP1s (1∶100,美國BioLegend公司)表達。用ImagePro Plus 6.0 (美國Media Cybernetics公司)檢測直徑1 mm的圓柱體區域中積分吸光度來反映XBP1s的表達強度。通過計算積分吸光度與總面積的乘積來代表XBP1s平均密度。

RT-PCRTrizol法(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA,逆轉錄為cDNA后,通過SYBR Green法(瑞士Roche公司)行實時熒光定量PCR檢測。反應體系(20μL):SYBR Premix Ex Taq 10μL,上下游引物各1μL,cDNA模版2μL,ddH2O 6μL。反應條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;58 ℃,30 s;72 ℃延伸30 s,共40個循環。

Westernblot將細胞裂解,提取組織蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,于10%脫脂奶/TBST中封閉,加入抗人IRE1α抗體(1∶1 000,美國Cell Signaling 公司);抗人XBP1s抗體(1∶500,美國BioLegend公司)或抗人GAPDH抗體(1∶5 000,英國Abcam公司),4 ℃過夜,加入二抗,顯色。

結 果

XBP1s在人黑色素瘤組織中的表達對61對黑色素瘤及瘤旁正常組織行XBP1s免疫組化檢測(圖1A),發現XBP1s在黑色素瘤組織中顯著高表達,主要位于細胞核,細胞質中也有部分表達(圖1B)。進一步檢測XBP1s的mRNA水平,發現XBP1s的mRNA水平在黑色素瘤中亦顯著升高(圖1C),提示IRE1α-XBP1信號通路在黑色素瘤中處于激活狀態。

Representative images (A) and integrated optical density (IOD) (B) analysis of the immunohistochemical images of melanoma tissues and paired normal skin tissues from 61 melanoma patients.XBP1s level was analyzed by real-time PCR in both melanoma tissues and normal skin tissues (C).

圖1人黑色素瘤細胞中XBP1s的表達
Fig1ExpressionofXBP1sinhumanmelanomasamples

在正常黑色素細胞及黑色素瘤細胞中XBP1s水平的比較為了進一步證實XBP1s在黑色素瘤中的高表達,我們分別在2種正常黑色素細胞系(HEMn-MP和HEMn-DP)和6種黑色素瘤細胞系(Mel-RMu、MM200、Mel-CV、IgR3、A2058和SkMel-28)中檢測了XBP1s的mRNA水平。結果發現,剪接片段XBP1s的mRNA水平在所有黑色素瘤細胞系中相較正常黑色素細胞均顯著上升(P<0.05,圖2)。

Melanocytes:HEMn-MP and HEMn-DP;Melanoma cells:Mel-RMu,MM200,Mel-CV,IgR3,A2058 and SkMel-28.

圖2黑色素細胞和黑色素瘤細胞中XBP1s/XBP1t的mRNA水平
Fig2ThemRNAlevelofXBP1s/XBP1tinmelanocytesandmelanomacells

IRE1α-XBP1信號通路調控IL-6表達為了探究XBP1下游是否調控炎癥因子IL-6的表達,我們分別在正常黑色素細胞系HEMn-MP和黑色素瘤細胞系Mel-RMu中過表達XBP1s。結果表明,IL-6 mRNA水平在HEMn-MP細胞(圖3A)和Mel-RMu(圖3B)中顯著上升。接下來,我們擬闡明,調控XBP1剪接的重要蛋白質IRE1α是否參與IL-6的調控。通過轉染pCMV-IRE1α質粒,使HEMn-MP和Mel-RMu細胞系分別過表達IRE1α(圖3C)。IRE1α在內質網中的過度堆積導致自身磷酸化,激活其RNA酶活性,從而剪接XBP1。因此,HEMn-MP和Mel-RMu細胞系分別過表達IRE1α后,XBP1s mRNA水平顯著上升,使用針對IRE1α的RNA酶活性抑制劑4μ8C后,可顯著抑制XBP1s的轉錄水平(圖3D),證實IRE1α在黑色素細胞中調控下游XBP1的表達。為了進一步驗證IRE1α-XBP1通路調控IL-6表達,我們在過表達IRE1α 的HEMn-MP和Mel-RMu細胞系中檢測IL-6的mRNA水平。結果發現,過表達IRE1α后IL-6水平顯著上升,阻斷IRE1α的RNA酶活性后可使IL-6水平下降至接近基線水平(圖3E),提示IRE1α-XBP1信號通路可調控IL-6表達。

IRE1α-XBP1-IL-6信號通路促進黑色素瘤細胞的增殖大量的研究表明IL-6信號能促進細胞增殖[10],因此我們設想IRE1α-XBP1也能通過IL-6突進促進黑色素瘤細胞的增殖。我們用CCK8和BrdU方法檢測了黑色素瘤細胞系Mel-RMu的細胞增殖。結果表明,過表達IRE1α后,細胞增殖顯著上升,此效應可被IL-6中和抗體所阻斷,表明分泌型IL-6發揮了重要作用(圖4A和B)。過表達XBP1s后,可觀察到同樣的現象(圖4C和D),提示IRE1α-XBP1-IL-6信號通路促進黑色素瘤細胞的增殖。

A:mRNA levels of XBP1s and IL-6 as determined by real-time PCR in HEMn-MP;B:Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-XBP1s (XBP1s) or pCMV (Ctrl.);C:The IRE1α protein levels were determined by immunoblotting in both HEMn-MP and Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-IRE1α (IRE1) or pCMV (Ctrl.).XBP1 splicing (D) and (E) IL-6 expression levels were determined by real-time PCR in IRE1α-overexpressing HEMn-MP and Mel-RMu cells with 4μ8C treatment.(1)P< 0.05,(2)P< 0.01.

圖3IRE1α-XBP1通路調控IL-6表達
Fig3TheIRE1α-XBP1pathwayregulatesIL-6expression

討 論

盡管UPR途徑在黑色素瘤的發生發展中發揮重要作用,但其具體機制仍未闡明。本研究揭示了IRE1α依賴的XBP1s途徑通過上調IL-6信號分泌IL-6促進黑色素瘤細胞的增殖。

XBP1s作為IRE1α的間接產物,是一種重要的反式作用因子,可調控大量的基因表達,從而緩解內質網應激,維持內質網穩態。除了在內質網應激中的重要作用[11],IRE1α-XBP1通路還參與調節很多生理性途徑,如PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha)[12]和Fasn(fatty acid synthase)[13]等。此外,IRE1α-XBP1通路還具有非轉錄調節功能,如促進FoxO1(forkhead box O1)蛋白質的降解[14];在巨噬細胞中,XBP1s能與IL-6基因啟動子區結合,促進IL-6的轉錄[15],但其在黑色素瘤中的作用機制尚不明確。我們研究發現使用針對IRE1α的RNA酶活性抑制劑4μ8C后,可顯著抑制XBP1s的轉錄水平,同時降低IL-6的表達,而IL-6對細胞的增殖起關鍵作用,因此我們認為IRE1α RNA酶的活性是研究黑色素瘤治療的新靶標。

有學者報道IRE1α可以通過調節STAT3信號通路促進肝細胞增殖和肝臟再生[16],且已經證明IRE1α與胰島細胞的增殖[17]及一些腫瘤細胞的增殖[18]相關,但IRE1α-XBP1信號通路是否與黑素瘤細胞的生長有關尚不明確。我們的研究證實了IRE1α-XBP1s在促進黑色素瘤細胞增殖中起到關鍵作用,無論是過表達IRE1α還是XBP1s,IL-6的轉錄活性均明顯升高,且黑色素瘤的增殖顯著上升,若在培養體系中加入IL-6抗體,則可抑制過表達IRE1α和XBP1s所帶來的促瘤效應。綜上所述,我們認為URP途徑中的IRE1α-XBP1s信號通路通過促進IL-6的轉錄,促進了黑色素瘤細胞的增殖,且最終效應是由分泌的IL-6所致。本研究為黑色素瘤的防治提供了新的思路,也為將來的藥物開發提供了新靶點。

A:Cell proliferation was analyzed by CCK8 assay and BrdU assay in Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-IRE1α (IRE1) or pCMV (Ctrl.) and treated with anti-IL-6 antibodies;B:Cell proliferation were analyzed by CCK8 assay and BrdU assay in Mel-RMu cells transfected with plasmids pCMV-XBP1 (IRE1) or pCMV (Ctrl.) and treated with anti-IL-6 antibodies.(1)vs.Ctrl.group (Student’sttest,one-way or two-way ANOVA),P<0.05;(2)vs.IRE1+anti-IL-6 or XBP1s + anti-IL-6 groups (Student’sttest),P<0.05.

圖4IRE1α-XBP1-IL-6信號通路促進Mel-RMu細胞的增殖
Fig4IRE1α-XBP1-IL-6pathwaypromotesmelanomacellproliferation