晚期胰腺癌患者門靜脈血循環腫瘤細胞檢測的臨床應用價值

陳 頤 劉霄宇顏志平程潔敏龔高全劉凌曉李國平李長煜周國鋒余天柱王小林△

(1復旦大學附屬中山醫院介入治療科 上海 200032; 2上海市影像醫學研究所 上海 200032)

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是指因自發或診療操作等原因脫離原發灶或轉移灶進入血液循環的腫瘤細胞,在腫瘤轉移的發生發展中起重要作用[1]。進入血液循環的CTCs由于受到免疫識別殺傷、血流剪應力破壞以及自身凋亡等因素影響,在外周靜脈中的含量極低,通常認為一般腫瘤人群的外周血中每1億個血細胞中僅有1個CTCs[2]。而消化系統血液由門靜脈回流后,經肝臟濾過再進入外周靜脈,外周靜脈的CTCs含量更低[3]。Allard等[4]報道消化系統腫瘤外周血的平均CTCs計數為(2～24)/7.5 mL,低于人體其他系統的腫瘤,如前列腺癌(75/7.5 mL)、乳腺癌(84/7.5 mL)、膀胱癌(42/7.5 mL)。消化系統腫瘤中,胰腺癌外周靜脈平均CTCs計數為2/7.5 mL,低于同樣經門靜脈引流的胃癌(24/7.5 mL)和結直腸癌(4/7.5 mL),這可能與胰腺癌組織中基質成分較多有關,與其他腫瘤相比,在同樣條件下進入血循環的CTCs數量較少。以上因素成為胰腺癌的CTCs研究明顯滯后于其他腫瘤的主要原因之一。

近年來,有研究人員在胰腺癌切除術中,分別抽取患者門靜脈血和外周靜脈血分離CTCs進行計數比較,發現門靜脈的單位血樣中CTCs檢出率和計數均高于外周靜脈[5-6]。因此,胰腺癌的CTCs研究有望通過獲取CTCs含量較高的門靜脈血樣尋找突破口。但是門靜脈系統在腹部較深位置,周圍解剖結構復雜,通常情況下,難以獲取晚期胰腺癌患者門靜脈血,本研究采用介入微創方法穿刺肝內門靜脈獲取晚期胰腺癌患者門靜脈血,以期獲得較高豐度的CTCs,為胰腺癌CTCs的分子生物學和功能研究奠定基礎。

資 料 和 方 法

病例隊列納入病例為2016年2月—12月于復旦大學附屬中山醫院介入治療科接受治療的晚期胰腺癌患者。納入標準:(1)無法手術切除的晚期胰腺癌(依據NCCN 2016版);(2)ECOG評分<2分;(3)未接受過全身化療、放療等針對胰腺癌的治療;(4)白細胞計數≥4×109/L,血小板計數≥100×109/L;(5)血清丙氨酸氨基轉移酶≤1.5倍正常值、血清總膽紅素≤1.5倍正常值(伴梗阻性黃疸的患者先行經皮經肝膽管引流);(6)肌酐≤115 μmol/L;(7)凝血酶原時間延長≤2 s。排除標準:(1)有肝臟穿刺禁忌癥;(2)血管造影禁忌癥;(3)患者有其他腫瘤病史;(4)預計生存期<3個月。本研究涉及的標本收集經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。

晚期胰腺癌門靜脈血獲取局部晚期病例如能在超聲導引下穿刺原發灶,用21G超聲穿刺針(日本八光公司)行原發病灶抽吸活檢;伴肝轉移病例,超聲導引下用18G活檢針(美國Cook公司)行轉移灶穿刺活檢。超聲導引下用21G超聲穿刺針,經右側肋間經皮穿肝并穿刺進入門靜脈右支主干,確認針尖位于門靜脈腔內后拔除針芯,抽取門靜脈血15 mL,拔除穿刺針,部分患者同時抽取外周靜脈血7.5 mL。采用Seldinger穿刺法穿刺股動脈,行動脈化療灌注/化療栓塞術,術后常規心電監護6 h。

CTCs的富集打開CTChip芯片,記錄芯片編號,微孔朝下放入到芯片卡槽中。使用ClearCell?FX1收集CTCs。

CTCs的涂片與染色配制抗體及相關試劑:一抗CD45,一抗CK18,二抗MS488,二抗RB568,DAPI溶液,4% PFA固定液,Trition×100穿透液。將細胞沉淀20 μL液體重懸后,加入到用免疫組化筆所畫的區域內,放置通風處吹干;4% PFA固定液,固定15 min;Trition×100穿透液,充分接觸1 h;PBS沖洗5 min,1次;一抗CD45和CK18室溫靜置30 min;PBS沖洗5 min,3次;加二抗溶液MS488和RB568,室溫靜置30 min;同樣PBS沖洗5 min,3次;經DAPI/CK18/CD45染色后,在InCell儀器中查看時,腫瘤細胞應在藍色和綠色通道呈現,白細胞應在藍色和紅色通道呈現(圖1)。

CTCs:DAPI+/CK+/CD45-;WBC:DAPI+/CK-/CD45+(DAPI:blue;CK:green;CD45:red).

圖1CTCs鑒定
Fig1CTCsidentification

CTCs圖像獲取與計數應用InCell Analyzer 2000獲取CTC細胞圖像及計算CTC數量。

CTCs的CD133表征(1)準備試劑:一抗CD133,CK18;二抗MS488,RB568;DAPI溶液;Trition 溶液;PBS溶液;Immuno Enhancer Kit稀釋液,4% PFA固定液。(2)涂片固定與染色:將上述CTCs固定和染色中一抗替換成一抗CD133,CK18,余相同。(3)CD133+CTCs染色圖像獲取與計數:同上。

觀察指標(1)術中觀察動脈造影表現、有無出血征象、術后有無出血癥狀和體征。(2)部分患者門靜脈和外周靜脈CTCs分別計數,并進行比較。(3)所有患者門靜脈CTCs計數,觀察性別、年齡、CA19-9、CEA、原發灶是否侵犯門靜脈系統,是否伴有肝轉移、原發灶部位以及原發灶最大徑和CTCs計數的相關性。(4)分別觀察門靜脈和外周靜脈CTCs的CD133表征。

統計學方法采用EpiData 3.1軟件錄入患者基線數據和臨床信息,分組比較采用Wilcoxon秩和檢驗或χ2檢驗。研究中數據缺失值不納入分析。所有統計檢驗均為雙側檢驗,檢驗水準α設為0.05。所有相關性研究采用最小二稱法擬合線性相關。

結 果

患者基本信息共計入組患者29例,其中男性19例、女性10例,平均年齡62.9歲(42～79歲),局部晚期16例、伴肝轉移13例(表1)。17例患者胰腺癌診斷經病理證實,12例經影像學和血液生化檢查證實。29例患者均成功獲取門靜脈血15 mL,術中肝動脈造影均未見造影劑外滲征象,術后亦未出現失血癥狀和體征。

表1 29例晚期胰腺癌患者臨床病理資料Tab 1 Baseline characteristics of 29 patients with advanced pancreatic cancer

M:Male;F:Female;Y:Yes;N:No.

CTCs計數29例患者的門靜脈血中均檢測到CTCs,門靜脈CTCs平均計數為(282±50)/7.5 mL。前期14例外周靜脈取血的患者中,9 例(64.2%)患者外周靜脈檢測到CTCs,CTCs平均計數為(21±7)/7.5 mL。前期14例同時采集門靜脈血和外周靜脈血的患者門靜脈CTCs平均計數為(237±78)/7.5 mL,顯著高于外周靜脈(P=0.010 2,圖2)。

臨床病理特征和CTCs計數的相關性分析(表2) 29例患者中,13例(45%)伴有肝轉移的患者門靜脈CTCs平均計數為(449±81)/7.5 mL;16例(55%)局部晚期患者門靜脈CTCs計數為(126±18)/7.5 mL,肝轉移患者門靜脈CTCs計數顯著高于局部晚期患者,門靜脈CTCs數量與患者是否伴肝轉移具有統計學相關性(P=0.000 4,圖3)。

The mean count of CTCs in portal vein of (237±78)/7.5 mL was significantly higher than that in the peripheral vein blood of (21±7)/7.5 mL.

圖229例晚期胰腺癌患者門靜脈與外周靜脈CTCs計數
Fig2CTCscountinportalveinandperipheralveinof29patientswithadvancedpancreaticcancer

表2 門靜脈血CTCs計數和晚期胰腺癌患者臨床特征的相關性Tab 2 The correlation between the CTCs count and the clinical characteristics of patients with advanced pancreatic cancer

17例(59%)原發病灶侵犯門脈系統患者的門靜脈CTCs平均計數 (281±73)/7.5 mL,12例門靜脈系統未受侵犯患者門靜脈CTCs平均計數(282±66)/7.5 mL,兩者差異無統計學意義(P=0.991 4)。29例患者原發腫瘤瘤體最大徑1.8～6.0 cm,瘤體最大徑與門脈血中CTCs計數無顯著線性相關(圖4)。

圖3肝轉移晚期胰腺癌患者門靜脈CTCs計數顯著高于無肝轉移患者
Fig3ThemeancountinportalveinsamplesofCTCsinpatientswithadvancedpancreaticcancerandlivermetastasiswassignificantlyhigherthanpatientswithoutlivermetastasis

圖4 胰腺癌患者門靜脈血CTCs與原發腫瘤最大徑的相關性Fig 4 The correlation between the number of CTCs and the tumor diameter

前期14例患者門靜脈CTCs平均計數237/7.5 mL [(8～908)/7.5 mL],CD133+細胞1～95個,占5.9%(2.5%～12%),相應患者外周靜脈CTCs未發現CD133+細胞(圖5)。

討 論

近年來,通過外科術中獲取胰腺癌門靜脈血,分離獲得較高濃度的CTCs,使胰腺癌CTCs的研究看到了新的希望。本研究采用介入微創穿刺技術穿刺肝內門靜脈,獲取29例晚期胰腺癌患者門靜脈血樣均獲得成功,未出現并發癥。目前,已報道的唯一采用微創技術獲取門靜脈血進行CTCs檢測的研究來自Catenacci團隊[7]。與Catenacci等[7]的報道相比較,本研究采用超聲導引,較超聲內鏡導引操作更為簡便;21G穿刺針直徑更細,操作也更為安全,更值得在臨床上推廣應用。本研究前期14例晚期胰腺癌患者平均門靜脈CTCs明顯高于外周靜脈血的,表明胰腺癌的直接引流靜脈內CTCs濃度較高,預示晚期胰腺癌的門靜脈CTCs有著巨大的潛在研究價值,可以為胰腺癌CTCs的分子生物學和功能研究創造條件[8]。

A:DAPI+CK identified CTCs (white arrow);B:DAPI+CD133 identified CD133+CTC (white arrow);C:Merged figure (DAPI:Blue;CK:Green;CD133:Red).

圖5門靜脈部分CTCs表達CD133
Fig5CD133+CTCsinportalvein

本研究伴肝轉移患者門靜脈CTCs計數明顯高于局部晚期患者(P=0.000 4),這直接表明了門靜脈CTCs和肝轉移的相關性。有學者在其他消化道腫瘤的研究中得到相似的結果,Rahbari等[9]獲取同屬門靜脈系統的腸系膜上靜脈血液,發現Ⅲ期和Ⅳ期結直腸癌患者的CTCs檢出率有顯著差別。CTCs是介導腫瘤轉移的基礎,通過動態監測門靜脈CTCs,預判胰腺癌患者微轉移的發生,以及晚期患者病程中是否會出現轉移,具有重要的臨床研究價值[10]。

生物法和物理法是目前最常采用的兩種CTCs的富集技術[11]。CellSearch?系統是生物法中免疫吸附技術的代表,它可以捕獲上皮表型-上皮細胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)表達陽性的CTCs,是目前唯一經FDA批準用于轉移性乳腺癌、結腸癌和前列腺癌預后判斷CTCs檢測系統[12-14]。但是,CTCs在生成和轉移的過程中會產生上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),也就是腫瘤細胞失去極性、黏附性等上皮表型,轉化為代表較高遷移侵襲能力的間質表型,從而具有更強的侵襲轉移能力[15]。CellSearch?系統會遺漏具有間質表型的CTCs,無法完整分析整個CTCs群體特征。Khoja等[16]同時使用CellSearch?系統和屬物理法的ISET系統檢測了27例胰腺癌患者,并進行比較,發現ISET系統的CTCs檢出率為93%,而CellSearch?系統的檢出率僅為40%。ISET系統檢出的病例中,有9例為EpCAM陰性,3例為EpCAM弱表達。因此,CellSearch?系統檢出的EpCAM陽性CTCs僅為CTCs中的一個亞群。本研究采用的ClearCell?FX系統的分離過程不會對CTCs造成損傷,分離出的CTCs具有細胞活性,完全可以用于下游分子檢測、細胞培養、細胞水平研究和腫瘤動物模型建立等實驗[17-18]。值得注意的是,具有間質表型的CTCs可能更具侵襲性。有研究者分析了乳腺癌患者血樣中的EpCAM陰性CTCs[19],發現其中HER/EGFR/HPSE/Notch表達均為陽性的亞群具有較高的致瘤性,并證實這部分無法被CellSearch系統檢出的CTCs在裸鼠體內可以導致轉移灶的形成。本研究中所有病例均為晚期胰腺癌,同一腫瘤人群中,晚期患者具有間質細胞表型的CTCs細胞比例明顯高于早期患者[20]。

在其他腫瘤的CTCs研究中已經發現,有干細胞特征的CTCs和患者預后呈負相關,具有致瘤性和對化療藥物更強的耐受性[21-23]。CD133是一種跨膜糖蛋白,最初發現其在人體造血干細胞、神經干細胞、表皮干細胞等干細胞群中有一致的表達。目前研究表明,結直腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中均有CD133+的腫瘤細胞亞群,已成為多種實體腫瘤干細胞主要標志物之一[24]。腫瘤細胞群中,表達CD133的亞群擁有更強大的自我更新、侵襲轉移和致瘤能力[25-26];腫瘤人群中,CD133的表達和患者的預后呈負相關[27-29]。目前僅有通過CD133表征觀察胰腺癌外周靜脈血CTCs的研究報道[29]。本研究門靜脈血中CD133+CTCs為5.9%,表明晚期胰腺癌患者的門靜脈CTCs中存在干細胞特征細胞亞群;外周靜脈血未發現CD133+CTCs,可能由于門靜脈CTCs經過肝臟的“濾過”、機體免疫殺傷或自身凋亡,在外周靜脈血中數量明顯減少,已無法檢出CD133+CTCs。這一結果提示胰腺癌的直接引流靜脈-門靜脈血樣中的CTCs較外周靜脈更具有研究價值。

綜上所述,晚期胰腺癌患者的單位門靜脈血CTCs計數明顯高于外周靜脈,門靜脈CTCs計數與是否伴有肝轉移相關。晚期胰腺癌患者門靜脈CTCs中部分具有干細胞表征,具有潛在研究價值。