甜葉菊褐斑病的病原菌鑒定及MeJA的抗病作用

崔曉霞，束紅梅，蔣璐，何曉蘭，鞏元勇，倪萬潮，郭書巧

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甜葉菊褐斑病的病原菌鑒定及MeJA的抗病作用

崔曉霞，束紅梅，蔣璐，何曉蘭，鞏元勇，倪萬潮，郭書巧

（江蘇省農業科學院經濟作物研究所，南京 210014）

【目的】明確引起甜葉菊褐斑病的病原菌種類，分析MeJA在甜葉菊響應鏈格孢菌過程中的作用，為甜葉菊褐斑病的防治及抗病育種提供依據?！痉椒ā繉θ∽越K省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地的發病甜葉菊植株的葉片進行病原菌分離、純化培養，觀察菌落及分生孢子的形態、大小和病原菌的致病性。采用離體葉片接種的方法進行致病性測定。利用真菌通用引物ITS1和ITS4對7個致病菌株ST1-ST7的rDNA-ITS區進行擴增，對擴增產物進行回收和測序，并利用MEGA 7軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建基于病原菌的rDNA-ITS序列和GenBank中相關鏈格孢菌序列的系統發育樹，確定病原菌的種類。利用臺盼藍染色、光學顯微鏡觀察分析鏈格孢菌分生孢子在甜葉菊葉片上的萌發狀態及侵入葉片的方式。通過向馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）上外源添加MeJA分析其對鏈格孢菌菌絲生長的影響；對甜葉菊離體葉片飼喂MeJA并接種鏈格孢菌，觀察葉片對鏈格孢菌的抗性；采用qPCR方法分析JA通路相關基因在甜葉菊葉片接種鏈格孢菌前后的表達情況?！窘Y果】從甜葉菊發病葉片上共分離到7個菌株，所有菌株在PDA培養基上呈近圓形等徑輻射生長，氣生菌絲較為發達，初期為白色，后期逐漸變為不同程度的灰黑色，分生孢子單生或成鏈，多為近球形、倒棒狀或倒梨形，大小為（20.5—45.5）×（6.5—16.0）μm。將所分離得到的菌株接種于甜葉菊離體葉片上，發現7個菌株對甜葉菊葉片致病程度存在一定差異，ST2、ST3和ST7 3個菌株侵染葉片后病斑擴展速度快，致病力較強。3個致病力較強的菌株的rDNA-ITS序列長度分別為569、570和570 bp，通過系統進化樹分析，ST2、ST3與菌株KY814634.1、DQ491089.1等（、sp.，鏈格孢）的相似度達到99%—100%，ST7與菌株HQ402558.1（，細極鏈格孢）的相似度達到99%。對接種細極鏈格孢ST7分生孢子的甜葉菊葉片臺盼藍染色后的觀察結果發現，分生孢子可以從孢子的頭部、側面、尾部多個位置萌發，從葉片的氣孔和表皮細胞間隙侵入葉片表皮細胞內。外源施加濃度高于200 μmol·L-1的MeJA能有效抑制細極鏈格孢菌絲的生長；甜葉菊離體葉片飼喂100 μmol·L-1的MeJA后接種細極鏈格孢，病斑面積明顯小于對照，表明MeJA可增強甜葉菊對細極鏈格孢的抗性；JA通路相關基因和在甜葉菊接種細極鏈格孢后上調表達，和反之下調表達，表明JA通路參與甜葉菊對細極鏈格孢的響應。【結論】江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地甜葉菊褐斑病的致病菌為鏈格孢菌。細極鏈格孢菌絲可以從葉片的氣孔以及表皮細胞間隙侵入表皮細胞。外源施加MeJA能夠有效增強甜葉菊葉片對細極鏈格孢的抗性，在甜葉菊褐斑病的防治中具有很好的應用前景。

甜葉菊；褐斑?。绘湼矜呔?；病原菌鑒定；MeJA；信號通路

0 引言

【研究意義】甜葉菊（）是菊科、甜葉菊屬多年生草本植物。甜葉菊葉片富含黃酮類和甜菊糖苷類化學成分[1-2]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性；甜菊糖苷（steviol glycosides）則是一類新型天然甜味劑，具有甜度高、熱量低、安全無毒等特點[3]，逐漸成為食品和醫藥領域研究開發的熱點[4-5]。2017年筆者在江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地發現甜葉菊葉片上呈現不同程度的褐斑，發病嚴重的植株葉片全部枯萎，嚴重影響了甜葉菊的產量。因此，確定甜葉菊褐斑病的致病病原菌，對該病害的防治具有重要意義。【前人研究進展】鏈格孢菌是自然界中廣泛存在、危害嚴重的一種死體營養型植物病原真菌，多生于植物的枯死部分和衰弱瀕死的組織，或腐生于多種有機物質上或土壤中[6]。鏈格孢菌可引起多種植物特別是農作物病害，能夠引起包括小麥、馬鈴薯、玉米、煙草、番茄、蘋果、梨等幾十種農作物的真菌性病害，嚴重影響作物的產量和品質，造成巨大的經濟損失[7-8]。美國伊利諾斯州的大豆曾因細極鏈格孢（）引起的大豆猝倒病，造成產量損失15%[8]。由長柄鏈格孢（）和鏈格孢（）引起的煙草赤星病在世界各主要煙區廣泛發生，主要危害成熟期煙葉，對成熟度、采收率、外觀等級和內在質量都有很大影響，是煙草的主要病害之一[9-10]。我國各地廣泛發生的番茄、馬鈴薯等茄科蔬菜的早疫病，則是由為主的病原真菌引起的[11-12]。1982年，日本首次發現一種鏈格孢屬真菌能引起甜葉菊黑斑病[13]，病斑呈黑色不規則形狀擴展，并被褪綠區域包圍；2007年，印度也首次報道了導致甜葉菊葉斑病的病原菌，鑒定結果為鏈格孢[14]；伊朗于2015年首次分離鑒定到鏈格孢菌屬為引起甜葉菊葉斑病的致病病原菌[15]。【本研究切入點】目前，國內關于甜葉菊病害病原物鑒定方面的報道還很少，對鏈格孢菌的防控并沒有非常有效的方法，因此了解其侵染機理可為該真菌導致的病害防控提供指導。對2017年7月采自江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地的帶病斑甜葉菊葉片進行病原菌分離鑒定和致病性檢測，并進一步分析MeJA對甜葉菊響應鏈格孢菌的影響?！緮M解決的關鍵問題】利用形態學與分子生物學手段鑒定甜葉菊褐斑病的致病病原菌，明確甜葉菊褐斑病的病原菌種類；分析MeJA對甜葉菊響應鏈格孢菌的影響以及JA通路是否參與該響應過程，為該病害的田間診斷、綜合防控及甜葉菊的抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2017年7月至2018年4月在江蘇省農業科學院經濟作物研究所完成。

1.1 褐斑病標樣采集及病原菌分離

2017年7月從江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地采集葉片帶有褐斑的植株。選取葉片病健交界的組織，切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，首先用無菌水沖洗數次，用70%酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞處理2 min，用無菌水漂洗3次，最后用滅菌鑷子夾取材料平鋪于添加有鏈霉素（40 μg·mL-1）的PDA平板培養基上，25℃黑暗條件下培養3—5 d，從新長出的菌落邊緣挑取少量菌絲接種到新的PDA平板上進一步分離純化，記錄菌落的形態學特征。

1.2 病原菌的致病性測定

選擇健康無病、無傷痕的甜葉菊葉片，室內進行離體葉片接種試驗。每個菌株均為3次重復。用70%酒精進行表面消毒后置于鋪有保濕濾紙的培養皿內。

菌絲塊接種法：分離純化的菌株在PDA平板上培養7 d，用滅菌刀沿菌落邊緣切取3 mm×3 mm大小的菌餅，菌絲面朝下、避開主葉脈貼于葉片背面兩側，接種部位用刺針進行人工創傷。同時接種空白的PDA培養基塊作為對照。接種后封好培養皿，置于25℃條件下誘導發病，每天觀察并記錄發病情況。

分生孢子懸浮液接種法：將菌株在PDA平板上于黑暗條件下培養10 d，加入10 mL無菌水刮洗菌絲，所得到的懸浮液經3層紗布過濾，在顯微鏡下使用血球計數板來計算孢子懸浮液的濃度，最終將孢子懸浮液濃度調至1×105個/mL。將表面消毒處理后的甜葉菊葉片浸到孢子懸浮液中10 min，然后將其轉移到鋪有保濕濾紙的培養皿內，于25℃條件下培養，在光學顯微鏡下觀察分生孢子的萌發以及侵染情況。

待接種后的甜葉菊葉片發病后，根據柯赫式法則，將病原菌重新進行分離純化，觀察新分離物與接種菌是否相同。

1.3 病原菌形態學觀察

將分離得到的致病菌株接種到PDA培養基上，置于25℃培養箱中黑暗培養8 d后，從菌落邊緣表面切取小塊薄的、帶菌絲的培養基，將其放置到載玻片上，覆上中心鑿有1 cm2方孔的紙片，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡（Olympus CX41，Japan）下觀察分生孢子、分生孢子梗及分生孢子鏈的形態并拍照，用目鏡測微尺測量分生孢子的大小。結合病原菌菌落在PDA培養基上的形態及色澤特征，參考《真菌鑒定手冊》[16]確定病原菌的種類。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定

1.4.1 總DNA的提取 將分離得到的菌株接種到PDA培養基上，置于25℃培養箱中培養10 d，從培養基表面刮取菌絲，加入液氮迅速研磨成粉末，參照真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，China）操作說明提取菌株DNA，并將DNA樣品放于-20℃保存備用。

1.4.2 ITS區擴增 采用真菌核糖體基因轉錄間隔區的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對病原菌的基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL：DNA模板2 μL、上下游引物ITS1和ITS4各1 μL、10×PCR buffer（Mg2+plus）5 μL、dNTP Mixs（10 mmol·L-1）1 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、無菌ddH2O補齊至50 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共33個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4.3 PCR產物純化與克隆 取5 μL 1.4.2中的PCR擴增產物加入1 μL 6×DNA loading buffer混勻，于1%瓊脂糖凝膠上檢測樣品條帶大小是否正確并特異。檢測正確的PCR產物使用PCR清潔試劑盒（Axygen，USA）回收純化，將其與pEASY-T1克隆載體（TransGen，China）連接，連接產物轉入大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞（TransGen，China）中，經PCR鑒定后，選取陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.4.4 病原菌的ITS序列分析 將測得的ITS區序列在GenBank中進行同源性搜索，與已報道真菌菌株的ITS區序列進行同源性比較。利用MEGA 7軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。將比較結果與病菌的形態特征、培養性狀和致病性結合，對病原菌進行鑒定。

1.5 細胞學染色

等體積的乳酸、苯酚、甘油和無菌ddH2O混合，制成乳酸酚溶液；向其中加入Trypan Blue染料溶解，使其終濃度為2.5 mg·mL-1，配成Trypan Blue染液。

Trypan Blue染液中加入2倍體積的無水乙醇，將樣品置于染色液中100℃煮1 min，室溫放置5—10 min；轉移至無水乙醇﹕乳酸酚=2﹕1溶液中過夜脫色，重復直至葉片綠色完全褪去；樣品于70%甘油中保存，制片并觀察。

1.6 MeJA對鏈格孢菌生長的影響

1.6.1 MeJA培養基的配制 取223.6 μL的MeJA溶于10 mL無水乙醇中，配成100 mmol·L-1的濃縮液，分別加入到PDA培養基中配成0、40、100、200、500 μmol·L-1含不同濃度MeJA的混合培養基。

1.6.2 菌絲生長檢測 鏈格孢菌株ST3在PDA培養基上培養5 d后，用打孔器在菌落邊緣均勻打下菌絲塊，將菌絲塊分別放在上述含不同濃度MeJA的PDA平板中央，每個處理重復6次。將其置于25℃培養箱中黑暗培養，每2 d觀察并測量菌落直徑。

1.7 離體葉片飼喂及培養

選擇生長狀態良好、長勢一致的甜葉菊植株，剪取離體葉片放入鋪有一層濾紙的培養皿中，濾紙加滅菌水浸濕，用浸泡100 μmol·L-1MeJA溶液的無菌棉包裹葉柄切口，進行離體飼喂，對照用浸泡無菌水的棉球處理。室溫下靜置10 h后取下棉球，重新用無菌水浸濕的棉球包裹葉柄處（方法參照Sun等[17]）。接種方法參照1.2的菌絲塊接種法。接種后的葉片置于培養皿中于溫度28/23℃、光周期16/8 h的光照培養箱中培養，分別于接種后3、4、5 d測量病斑并拍照記錄。

1.8 RNA提取及qRT-PCR

樣品RNA的提取采用E.Z.N.A.?Plant RNA Kit（OMEGA，美國）試劑盒，按照說明書進行RNA的提取操作?；蚪MDNA去除及RNA反轉錄采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，Japan）試劑盒并按說明書操作。

qRT-PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，Japan）試劑盒，PCR反應在QuantStudio 5 Real-Time PCR System（Applied Biosystems，American）儀器上進行。PCR反應結束后擴增Ct值經QuantStudioTMDesign & Analysis Software 1.3.1軟件初步處理后導出至Excel中，利用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。數據采用Dunnett’ s test進行顯著性分析。所用甜葉菊內參基因及JA通路各目的基因引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用引物核酸序列

2 結果

2.1 病原菌的分離純化及形態學特征

從甜葉菊守田3號發病葉片中分離出7種疑似致病真菌，依次編號為ST1—ST7。所有菌株在PDA培養基上呈近圓形等徑輻射生長，邊緣光滑略呈波浪狀；氣生菌絲較為發達，初期為白色，后期逐漸變為不同程度的灰黑色，基質呈現不同類型的同心輪紋（圖1）；在PDA平板上培養8 d的菌落產生大量的分生孢子，顯微鏡下觀察，分生孢子梗直立或略彎，分隔，偶分枝，淡褐色，大小為（24.0—77.5）×（2.3—5.0）μm；分生孢子單生或成鏈，形態多樣，多為近球形、倒棒狀或倒梨形，大小為（20.5—45.5）×（6.5—16.0）μm（圖2）。其中ST2、ST3、ST5、ST6具有短分枝的孢子鏈，作合軸式延伸，分生孢子表面光滑或具微刺，具3—8個橫膈膜和1—4個縱、斜隔膜；ST1、ST4、ST7則形成超過10個孢子的分生孢子長鏈，少分支，處于鏈基部的孢子，表面偶生明顯的疣突，分生孢子具4—7個橫膈膜，1—4個縱或斜隔膜，常有1—4個主橫膈膜，主隔膜處有明顯的隘縮。根據這些特征，參照魏景超的《真菌鑒定手冊》[16]及張天宇的《中國真菌志》[6]初步判定此類菌為鏈格孢屬霉菌，其中ST2、ST3、ST5、ST6可能是，ST1、ST4、ST7則推測是。

ST1—ST7在PDA平板上25℃條件下培養10 d后的正面和反面菌落形態

圖2 分離病原真菌分生孢子形態的顯微觀察

2.2 病原菌的致病性檢測

采用離體葉片接種的方法，對葉片發病情況進行觀察統計，結果發現7個菌株對甜葉菊葉片致病程度存在一定的差異，ST2、ST3和ST7 3個菌株侵染葉片后病斑擴展速度快，在接種后72 h病斑直徑達到3—5 mm，發病位置呈黑褐色（圖3-B、3-C、3-G），而ST1、ST4、ST5和ST6在接種后的第7天病斑仍局限于葉片的創傷位點（圖3-A、3-D、3-E、3-F）。因此，引起甜葉菊葉片褐斑病的ST2、ST3和ST7菌株的致病力較強，而ST1、ST4、ST5和ST6對甜葉菊的致病力則相對較弱。從接種發病的葉片病斑上刮取少量的病組織鏡檢，可觀察到與接種菌株一致的菌絲和分生孢子。對發病組織進行病原菌的再分離，同樣獲得與接種病原真菌菌落形態一致的培養物，完成柯赫氏法則（Koch postulates）致病性檢測。因此，接種所用的菌株是引起甜葉菊褐斑病的病原菌。

A—G：甜葉菊葉片分別接種ST1-ST7菌株的表型The phenotype of S. rebaudiana leaves inoculated with ST1-ST7 strains, respectively；H：接種無菌空白PDA培養基的對照The control leaf inoculated with PDA medium

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析

以菌株ST1—ST7的基因組DNA為模板，利用真菌rDNA-ITS區通用引物ITS1和ITS4，擴增得到571、569、570、570、570、571和570 bp大小的ITS序列（圖4），并進行測序分析，將測序結果提交至NCBI網站進行BLAST比對（圖5）。結果表明，ST2、ST3、ST5、ST6與KY075667.1、KY814634.1等8個菌株（、sp.）的相似性達到99%—100%，ST1、ST4、ST7與HQ402558.1（）的相似性達到99%，結合病原菌的形態學觀察結果，進一步確認引起甜葉菊褐斑病的病原菌為鏈格孢和細極鏈格孢。

2.4 細極鏈格孢分生孢子在葉片上的萌發及侵入

甜葉菊品種守田3號葉片接種細極鏈格孢ST7（以下試驗將該菌株作為研究對象）分生孢子懸浮液（1×105個/mL），利用光學顯微鏡觀察發現，接種6 h后，分生孢子已經開始萌發，分生孢子可以從孢子的頭部、側面、尾部多個位置萌發（圖6-A、6-B、6-C），菌絲沿葉片表面蔓延生長。接種24 h后，對菌絲侵入表皮細胞的方式進行觀察，發現一部分菌絲通過葉片的氣孔侵入表皮細胞（圖6-D、6-E、6-F），一部分則從表皮細胞間隙直接侵入葉片表皮細胞內（圖6-G、6-H）。

圖4 7株鏈格孢菌的rDNA-ITS PCR產物電泳圖

2.5 JA通路參與甜葉菊對鏈格孢菌的響應

2.5.1 MeJA對鏈格孢菌菌絲生長的影響 選擇細極鏈格孢菌株ST7在含有不同濃度MeJA的PDA培養基上培養，菌絲生長面積統計結果如圖7所示。MeJA濃度低于200 μmol·L-1時，菌落生長面積與對照相比無明顯差異；當MeJA濃度增至200 μmol·L-1時，鏈格孢菌菌絲的生長受到明顯抑制，且隨著MeJA濃度增至500 μmol·L-1，對其生長的抑制效果更顯著。MeJA在較低濃度范圍內對細極鏈格孢菌ST7沒有直接的抑制作用，因此，選擇濃度為100 μmol·L-1的MeJA用于后續的試驗處理。

2.5.2 外源施加MeJA增強甜葉菊對細極鏈格孢的抗性 對外源施加100 μmol·L-1MeJA的甜葉菊離體葉片接種細極鏈格孢ST7菌絲塊，同時對葉片接種無菌PDA培養基作為空白對照。接種后的病斑表型如圖8-A所示，相比于對照H2O處理的葉片，MeJA處理后甜葉菊葉片的病斑明顯減小。病斑統計結果（圖8-B）顯示，接種后3、4、5 d，對照葉片的病斑面積分別是MeJA處理后葉片病斑面積的1.41、1.50和1.58倍，結果表明外源施加MeJA后，甜葉菊葉片對細極鏈格孢ST7的抗性明顯增強。

圖5 甜葉菊褐斑病7個致病菌與鏈格孢菌屬相關種rDNA-ITS序列系統發育樹

甜葉菊品種守田3號接種細極鏈格孢ST7 6 h后，分生孢子從孢子的頭部（A）、側面（A、B）、尾部萌發（C）；接種24 h后，菌絲從葉片氣孔（D、E、F）、表皮細胞間隙（G、H）侵入葉片表皮細胞內

圖7 MeJA對細極鏈格孢ST7菌絲生長的影響

I：甜葉菊葉片飼喂100 μmol·L-1 MeJA 10 h后接種細極鏈格孢ST7的表型The phenotype of S. rebaudiana leaves which inoculated with ST7 after feeding 100 μmol·L-1 MeJA for 10 h；II：葉柄處飼喂ddH2O后接種細極鏈格孢ST7的表型The phenotype of S. rebaudiana leaves which inoculated with A. tenuissima ST7 after petiole feeding ddH2O；III：葉片飼喂ddH2O并接種無菌PDA培養基的空白對照 The control which leaves inoculated with PDA medium。拍照及測量病斑時間點均為接種后3、4、5 d The time points for taking pictures and measuring the disease spots are 3, 4, 5 days after inoculation

2.5.3 JA通路相關基因的表達分析是JA合成通路基因，在甜葉菊葉片接種細極鏈格孢菌株ST7分生孢子懸浮液12 h后，明顯上調表達；JAR則是JA通路中的信號傳導因子，在接種后48 h后，的表達量顯著增加；JAZ是茉莉酸途徑的抑制因子，接種鏈格孢菌后，和呈現不同程度的下調表達（圖9）。表明JA通路相關基因參與甜葉菊對細極鏈格孢ST7的響應。

3 討論

甜葉菊提取物甜菊糖苷作為甜味食品添加劑在南美已使用了數個世紀[18]，最近在歐盟和美國也被批準使用[19]。甜菊糖苷同時具有一定的藥用價值，例如降低血壓、增強胰島細胞功能治療2型糖尿病、預防動脈粥樣硬化、預防某些癌癥以及清除人體自由基等功能[19-22]。我國的甜葉菊自1976年南京中山植物園從日本引種試驗成功后，80年代初全國各地開始種植[23]。自2006年起，中國成為世界甜菊糖產品最大的出口國[4]。目前關于甜葉菊病害已有相關報道。2002年，朱東順等[24]在山東省高密地區發現甜葉菊生產中發生的主要病害有立枯病、花葉病毒病和葉斑病等，對甜葉菊的干葉質量和產量均造成不同程度的影響。近年來甘肅河西走廊地區甜葉菊育苗期的病害呈逐年加重的趨勢，猝倒病、立枯病和葉斑病成為育苗期最容易發生的3大病害，給農業生產帶來較大損失[25]。2017年，筆者在江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地調查發現甜葉菊葉片上呈現不同程度的褐斑，發病嚴重的植株葉片全部枯萎。經病原菌的分離、培養、純化，共分離得到7株病原真菌，均為鏈格孢屬真菌，致病性鑒定結果發現有3株致病力較強，為細極鏈格孢和鏈格孢。

圖9 JA通路相關基因響應細極鏈格孢侵染的表達分析

JA是植物細胞間和細胞內的重要信號分子，通過與轉錄因子間的相互作用來調控防御蛋白的表達以及次生物質的合成，參與植物對病原菌的應答反應和信號傳遞[26-27]。本試驗表明，100 μmol·L-1的MeJA對鏈格孢菌無直接抑制作用，而用該濃度MeJA處理后的甜葉菊葉片對鏈格孢菌的抗性明顯增強，具有顯著的誘抗作用，說明MeJA在增強甜葉菊抗鏈格孢菌方面起著重要作用。脂氧合酶（lipoxygenase）基因是JA合成通路中的關鍵基因，當植物受到傷誘導時，被激活，誘導JA及MeJA的合成與積累，而生成的JA又可進一步激活，促進JA的積累[28]，在甜葉菊葉片受鏈格孢菌侵染后，的表達水平明顯上調。JAZ蛋白作為E3泛素連接蛋白降解復合體SCF的靶蛋白，是JA信號轉導途徑的關鍵組分，其能與茉莉酸信號途徑的轉錄因子（如MYC2、MYC3）相結合從而抑制這些因子的轉錄活性，JAZ蛋白是茉莉酸信號途徑重要的負調控因子[29]，本研究用鏈格孢菌侵染甜葉菊后，葉片中、的表達受到抑制，與接種前相比，整體呈下調表達的趨勢。JAR1是一種茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）合成酶，被認為是擬南芥JA通路中必需的信號轉導因子[30]，本研究中甜葉菊響應鏈格孢菌的侵染，接種48 h后表達量顯著上調，表明在甜葉菊受鏈格孢菌侵染時，JA信號通路基因的表達發生相應的改變，提高植物體內JA水平，對病原菌的侵染作出響應。

4 結論

根據真菌形態鑒定、致病性鑒定以及病原菌rDNA-ITS序列同源性分析結果，確定甜葉菊褐斑病的致病菌為鏈格孢及細極鏈格孢。顯微觀察發現細極鏈格孢菌絲可以從葉片的氣孔以及表皮細胞間隙侵入表皮細胞。外源施加MeJA能夠有效抑制細極鏈格孢菌絲的生長，MeJA處理后的甜葉菊葉片對細極鏈格孢的抗性明顯增強，具有顯著的誘抗作用，在甜葉菊褐斑病的防治中具有很好的應用前景。

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（責任編輯 岳梅）

Identification of Pathogens Causing Brown Spot and the Role of MeJA in Disease Resistance in

Cui Xiaoxia, Shu Hongmei, Jiang Lu, He Xiaolan, Gong Yuanyong, Ni Wanchao, Guo Shuqiao

(Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014)

【Objective】The objective of this study is to identify the pathogenic fungus causing brown spot disease on, and analyze the role of MeJA in response toto provide a basis for disease prevention and resistance breeding. 【Method】The samples of diseasedleaves were collected from the stevia production base of Fuan Town, Dongtai City, Jiangsu Province. After isolation and purification, the isolates were identified by using the methods of morphological characteristics analysis. Morphology parameters mainly included the colony and conidial morphology, conidial size. The isolates pathogenicity was tested on detachedleaves. The internal transcribed spacer (ITS) rDNA region of the 7 pathogenic strains was amplified by using the fungal universal primers ITS1 and ITS4, and then the amplified product was recovered and sequenced. MEGA 7 was used to construct phylogenetic tree to confirm the pathogen species based on the rDNA-ITS sequence and the relatedsequences in GenBank. The germination status ofconidial spores and the way they invaded the leaves after stained with trypan blue were analyzed by microscopy. The effect on the growth ofmycelium was analyzed by exogenous application of MeJA to potato dextrose agar (PDA) medium. To test the role of MeJA in theresistance to, detached leaves were fed with MeJA and then used for infection. The qPCR method was performed to analyze the expression of JA pathway-related genes before or after inoculation within leaves of. 【Result】Sevenstrains were collected from the diseasedleaves. All the strains grew on the PDA medium in a nearly circular and equal diameter radiation. The aerial hyphae were relatively developed, with white at the beginning and gradually changed to different degrees of grayish black at the later stage. The conidia are solitary or in a chain, mostly nearly spherical, inverted bar-shaped, or inverted pear-shaped, with a size of (20.5-45.5) × (6.5-16.0) μm. The isolated 7 strains were inoculated on the detached leaves of, and the pathogenicity was different. ST2, ST3 and ST7 strains led to the lesions spread rapidly with stronger pathogenicity. The rDNA-ITS sequence length of the ST2, ST3, and ST7 strains was 569, 570, and 570 bp, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that the similarity of ST2 and ST3 with strains KY814634.1 and DQ491089.1 (,sp.) is between 99%-100%, and similarity between ST7 and strain HQ402558.1 () is 99%. The results of trypan blue staining ofleaves inoculated withshowed that conidia of ST7 could germinate from the head, lateral and caudal of the spores, and themycelia could invade into epidermal cells from the stomata or the epidermis intercellular. Exogenous application of MeJA could effectively inhibit the growth ofmycelia when the concentration of MeJA was higher than 200 μmol·L-1. After inoculated with, the lesion area of detached leaves that fed with 100 μmol·L-1MeJA was significantly smaller than that of the control, indicating that MeJA could enhance theresistance to. JA pathway related genes were involved in the response ofto, the expression ofandwas up-regulated while the expression ofandwas down-regulated afterinoculated with.【Conclusion】The pathogenic fungus that causedleaf brown spot in the stevia production base of Fuan Town, Dongtai City, Jiangsu Province was identified as.mycelia can invade epidermal cells from the stomata or the epidermis intercellular space of the leaves. The resistance ofleaves towas enhanced after exogenous application of MeJA, which will become the potential candidates for the control ofbrown spot disease in the field.

; brown spot disease;; identification of pathogens; methyl jasmonate; signaling pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.008

2018-04-18；

2018-05-18

江蘇省科技計劃（SZ-SQ2017019）

崔曉霞，E-mail：cuixiaoxia7@163.com。通信作者郭書巧，Tel：025-84390290；E-mail：gsq925@163.com