CNPY2在胃癌中的表達及其與侵襲轉移、微血管密度的關系

馮芳　肖虹

【摘要】 目的：研究新型的分泌型促血管生成因子CNPY2在胃癌組織中的表達情況，分析其表達與侵襲、轉移及微血管密度之間的關系。方法：收集山西醫科大學第一醫院手術切除的胃癌組織及癌旁組織標本50例，采用western-blot檢測CNPY2的表達情況，免疫組織化學CD34染色計數微血管密度，分析CNPY2的表達與患者臨床病理特征及微血管密度之間的關系。結果：與癌旁組織相比，胃癌組織中CNPY2的表達顯著增高（P<0.05）；CNPY2在有淋巴結轉移腫瘤組織中的表達高于無淋巴結轉移（P<0.05），CNPY2在Ⅲ期+Ⅳ期腫瘤組織中的表達高于Ⅰ期+Ⅱ期（P<0.05）；CNPY2高表達的胃癌組織中腫瘤微血管密度顯著增高（P<0.05）；與腫瘤原發灶相比，CNPY2在轉移性淋巴結組織中的表達顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：CNPY2在胃癌組織中表達上調，可能在胃癌血管生成、侵襲轉移中發揮重要作用。

【關鍵詞】 胃癌； CNPY2； 微血管密度

Expression of CNPY2 in Gastric Cancer and Its Relationship with Invasion，Metastasis and Microvessel Density/FENG Fang，XIAO Hong.//Medical Innovation of China，2018，15（23）：0-038

【Abstract】 Objective：To study the expression of a novel secreted pro-angiogenic factor CNPY2 in gastric cancer and to analyze its relationship with invasion，metastasis and microvessel density.Method：Fifty cases of gastric cancer tissues and adjacent tissues were collected from the First Hospital of Shanxi Medical University.The expression of CNPY2 was detected by western-blot and microvessel density using immunohistochemistry CD34 staining.The relationship between CNPY2 expression and clinicopathological features and microvessel density was analyzed.Result：The expression of CNPY2 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissues（P<0.05）.The expression of CNPY2 in lymph node metastasis was higher than that in non-lymph node metastasis（P<0.05）.The expression of CNPY2 in stage Ⅲ+Ⅳ tumor was higher than that in stage Ⅰ+Ⅱ（P<0.05）.The density of tumor microvessel was significantly higher in CNPY2-overexpressing gastric cancer（P<0.05）.Compared with the primary tumor，the expression of CNPY2 in metastatic lymph node tissue was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：The up-regulation of CNPY2 in gastric cancer may play an important role in angiogenesis，invasion and metastasis of gastric cancer.

【Key words】 Gastric cancer； CNPY2； Microvessel density

First-authors address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.23.009

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，根據流行病學統計顯示，在我國胃癌的發病率及死亡率僅次于肺癌，居于第二位[1]。雖然以外科治療為主的綜合治療取得了一定的進展，但總體而言胃癌的預后不良[2]。腫瘤的生長、侵襲、轉移都依賴于腫瘤新生血管的生成[3-4]，CNPY2是一種新型胞漿分泌型蛋白，其生理作用主要是參與血管平滑肌細胞的生成和遷移、神經突的生長[5-6]，在缺氧狀態下CNPY2可誘導血管生成，被認為是一種分泌型血管生長因子[7-8]。據報道，CNPY2可能通過血管生成作用參與腫瘤的侵襲與進展[9-10]，本研究定量分析了胃癌組織中CNPY2的表達情況及其與微血管密度之間的關系，為胃癌的研究提供新的思路和試驗依據，現將試驗結果整理報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本來源于山西醫科大學第一醫院普外科2016年5月-2017年5月手術切除的胃癌組織，在不影響病理診斷的前提下留存癌組織及癌旁組織標本，臨床可疑轉移的淋巴結組織術中行冰凍切片檢查，如可見癌轉移，則留取少許淋巴結組織，所有標本立即置于-80 ℃低溫冰箱保存。入組患者均為初發、散發、無家族史，術前未經任何形式的放、化療及靶向治療，術后經常規石蠟切片病理診斷確診為胃腺癌。入組患者的臨床病例資料：男32例，女18例；年齡44～73歲，平均（55.2±9.9）歲；分化程度：高分化9例，中分化25例，低分化16例；Lauren分型：腸型33例，彌漫型17例；淋巴結轉移：未轉移27例，轉移23例；TNM分期（第八版）：Ⅰ期+Ⅱ期21例，Ⅲ期+Ⅳ期29例。試驗經患者知情同意，倫理審查通過，嚴格保護患者隱私。

1.2 主要試劑 兔源CNPY2一抗，美國proteintech公司；β-actin內參一抗及抗兔二抗，美國santa-cruz公司；CD34一抗，北京中杉金橋生物公司；組織裂解液及BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物公司；蛋白分子量marker，武漢博士德生物公司；硝酸纖維素膜，北京索萊寶生物公司；甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺等其余試劑為國產分析純產品。

1.3 蛋白印跡實驗 提取組織總蛋白：電子天平稱取組織0.5 g，眼科剪剪碎后加組織裂解液，于冰上勻漿，低溫離心取上清液，按照BCA蛋白定量檢測試劑盒步驟檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳：配制分離膠及濃縮膠，灌膠至玻璃板中，凝固后上樣加入蛋白樣品及蛋白分子量marker。加入電泳緩沖液，預電泳30 min，電壓60 V。電泳45 min，電壓120 V。濕轉膜：將凝膠及硝酸纖維素膜夾至轉膜板中，加入轉移緩沖液，轉膜25 min，電壓100 V。蛋白封閉：將裁好的膜置于5%蛋白干粉封閉液中，室溫輕搖1 h。顯色：CNPY2（1︰1 000）及β-actin（1︰1 000）一抗，4 ℃冰箱過夜反應。滴加二抗（濃度1︰3 000）中，室溫輕搖1 h。采用ECL電化學發光法顯色，成像儀下曝光攝片。CNPY2的表達量以其與內參β-actin灰度值比值表示。

1.4 微血管密度檢測 石蠟包埋，4 μm切片至過膠玻片上，免疫組織化學二步法CD34染色，按說明書步驟進行。CD34陽性表達部位定位于血管內皮細胞胞質。微血管密度MVD計數方法：兩名病理醫師在多人共覽顯微鏡下共同計數，首先在低倍鏡（40倍）下選擇腫瘤浸潤生長明顯、間質內小血管最豐富的區域作為熱點區，在高倍鏡（200倍）計數熱點區微血管數量。計數5個視野，取其平均值作為MVD數量[11-12]。

1.5 統計學處理 本研究數據采用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料用（x±s）表示，組內比較采用配對t檢驗，重復測量數據采用方差分析；計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CNPY2在胃癌及癌旁組織中的表達情況 蛋白印跡結果顯示，CNPY2在21 KDa處出現顯影條帶（圖1），經灰度分析：CNPY2在胃癌組織中的表達為（0.972±0.233），顯著高于癌旁組織（0.224±0.093）（t=6.656，P=0.000）。在胃癌組織中，CNPY2在不同性別、年齡、分化程度及Lauren分型中的表達比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但在淋巴結轉移及TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期癌組織中的表達顯著高于淋巴結未轉移及TNMⅠ期+Ⅱ期（P<0.05），見表1。

2.2 CNPY2在轉移性淋巴結組織及原發灶中的表達 CNPY2在轉移性淋巴結組織中的相對表達量為（1.507±0.451），與原發灶（0.867±0.168）相比，CNPY2在轉移性淋巴結組織中的表達顯著增高，差異有統計學意義（t=2.976，P=0.018），見圖2。

2.3 CNPY2的表達與MVD之間的關系 無論是否形成管腔結構，CD34陽性標記內皮細胞團亦按獨立的微血管分別計數，不連通的血管小分支結構也視為另一個微血管，有平滑肌細胞包繞的大血管或者管徑大于8個紅細胞的血管不視為微血管。CD34染色結果見圖3。以CNPY2表達的灰度值中位數為分界點，將其分為高表達及低表達組，低表達組胃癌組織MVD平均計數為（22.4±6.5），與低表達組相比，高表達組MVD計數（32.5±8.2）顯著增高，差異有統計學意義（t=-2.575，P=0.033）。

3 討論

CNPY2是一種新型的分泌型促血管生成因子，人類CNPY2基因定位于12號染色體。屬于Canopy家族成員（CNPY1、2、3、4）中的一員，其基因編碼蛋白分子量約21 KDa，由182個氨基酸組成[13]。CNPY2在哺乳動物機體各組織器官廣泛表達，尤其以胰腺、心臟及肝臟肝表達較高。Peng等[14]學者使用定量實時聚合酶鏈反應，免疫印跡和免疫組織化學分析檢測結直腸癌細胞系和組織中CNPY2的表達，結果發現CNPY2的表達在腫瘤細胞系和組織中比正常結腸上皮細胞和腫瘤鄰近的正常組織中顯著增加，并且可作為結直腸癌患者新的有價值的預后指標。Yan等[15]學者的研究表明：CNPY2敲低阻止腫瘤生長和血管生成并促進細胞凋亡，在HCT116CRC細胞系中CNPY2的敲減可逆地增加p53活性，p53激活增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，減少細胞周期蛋白依賴性激酶2，從而抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡，并減少體內和體外的血管生成。目前，CNPY2在腫瘤中的研究報道較少，在胃癌組織中尚未見相關報道。

本研究蛋白印跡定量分析結果表明，癌旁正常黏膜組織中CNPY2亦有表達，但其在胃癌組織中的相對灰度值顯著增高，提示CNPY2在胃癌組織中表達上調。在胃癌組織中，CNPY2在不同性別、年齡、分化程度及Lauren分型中的表達比較，差異均無統計學意義（P>0.05），但在淋巴結轉移及TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期癌組織中的表達均顯著高于淋巴結未轉移及TNMⅠ期+Ⅱ期的癌組織，與原發灶相比，CNPY2在轉移性淋巴結組織中的相對表達量顯著上調，上述結果提示CNPY2的表達可能與腫瘤的侵襲、轉移及預后相關。惡性腫瘤的相對無限生長是血管依賴性的[16]，作為腫瘤基質的重要組分，腫瘤新生血管可視為腫瘤增殖所必需的滋養系統，血管生成速度和密度是腫瘤侵襲、轉移的重要惡性表型[17-18]，微血管密度MVD被認為是指血管形成活動的標志[19]。本研究以胃癌中CNPY2表達的灰度值中位數為分界點，將其分為高表達及低表達組，通過CD34染色計數腫瘤MVD，與低表達組相比，高表達組MVD的計數顯著增高，提示CNPY2可能通過腫瘤血管生成參與胃癌發生發展的病理過程。

綜上，CNPY2在胃癌組織中表達上調，可能通過血管生成作用在胃癌的侵襲轉移中發揮重要作用，有望成為胃癌研究的有效預后因子和潛在基因靶點。

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（收稿日期：2018-04-02） （本文編輯：張爽）