單核鋨配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及其與DNA的作用

趙雅晨李 季 胡炯圣 劉 璐 王萌萌蘇 志 錢 勇＊, Peter J.Sadler 劉紅科＊,

(1南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

(2Department of Chemistry，University ofWarwick，Coventry CV4 7AL，UK)

癌癥作為導(dǎo)致人類疾病死亡的原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。治療癌癥的化療藥物主要有順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等鉑類藥物，然而在后期的使用過程中，這類藥物暴露出高毒性、耐藥性等問題[1-4]。因此，研究新型的抗癌藥物迫在眉睫，對(duì)于治療癌癥具有重要意義[5-6]。芳基金屬配合物由于其較低的細(xì)胞毒性、成鍵模式的多樣性等特點(diǎn)引起了很大的關(guān)注，被認(rèn)為是最有前景的金屬抗癌藥物之一[7-9]。鋨與釕性質(zhì)相似，金屬鋨類配合物也可作為潛在的抗癌藥物[10-11]。DNA是具有生物遺傳功能的分子，影響著細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯，是許多抗癌藥物作用的靶點(diǎn)[12-14]。

我們課題組最近報(bào)道了一種合成方法，用來合成含咪唑嗡離子的單核芳基釕配合物RuL2CH2[15]。基于這種合成方法，本文利用1，4-二(1-咪唑基-亞甲基)-2，3，5，6-四甲基苯(p-bitmb)與[(η6-cymene)Os(μ-Cl)Cl]2或[(bip)Os(μ-Cl)Cl]2反應(yīng)，合成了 2 種單核芳基鋨配合物。通過核磁共振氫譜研究了配合物中亞甲基的來源。用紫外光譜和圓二色譜(CD)研究了配合物與DNA的作用方式及配合物在緩沖溶液中的穩(wěn)定性，同時(shí)還研究了配合物對(duì)不同陰離子的響應(yīng)。

Scheme 1 Synthesis ofmononuclear Osギ-arenemetallamacrocyclic complexes 1 and 2 withmethylene bridge by a solvothermal reaction

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

CT-DNA和氘代試劑購自Sigma Aldrich，磷酸緩沖溶液(PBS)等均購自上海生物工程股份有限公司。實(shí)驗(yàn)所用溶劑均來自于國藥集團(tuán)，分析純，未進(jìn)行進(jìn)一步純化。晶體結(jié)構(gòu)用Bruker Smart ApexⅡCCD衍射儀進(jìn)行測(cè)試，1H NMR用Bruck AVANCE 400 MHz/Bruck AVANCE 600MHz核磁共振波譜儀測(cè)定，C、H、N元素分析使用元素分析儀 (vario ELⅢ，賀力氏公司，德國)測(cè)定。圓二色譜(CD光譜)通過英國Applied Photophysics公司生產(chǎn)的Chriascan儀器測(cè)定。采用Thermo LCQFLEET電噴霧質(zhì)譜儀測(cè)定配合物的m/z(Source voltage 4.0 kV，流動(dòng)相為甲醇/乙腈，流速為 200 pL·min-1，直接進(jìn)樣)，紫外吸收分光光譜儀為Varian Cary 50分光光度計(jì)。

1.2 配合物的合成

1.2.1 配合物[(p-cymene)Os(L)Cl]Cl3·CH2Cl2(1)(L=(p-bitmb)2CH2)

將 [(p-cymene)OsCl(μ-Cl)]2(0.012 5 mmol，9.8 mg)，1，4-二(1-咪唑基-亞甲基)-2,3,5，6-四甲基苯(pbitmb)(0.075 mmol，23.52 mg)加入 2.5 mL 的二氯甲烷溶液，超聲2～5min，放入裝有聚四氟乙烯的內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，放入80℃的烘箱，反應(yīng)48 h后冷卻至室溫，得到淡黃色晶體。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ10.13(s，2H)，8.48(s，2H)，8.24(d，J=1.8 Hz，2H)，7.95(s,2H)，7.62～7.29(m，4H)，6.37(d，J=14.1 Hz，1H)，6.20(d，J=14.1 Hz，1H)，5.93(d，J=5.4 Hz，2H)，5.76～5.67(m，2H)，5.56(d，J=15.1 Hz，2H)，5.49～5.39(m，4H)，5.34(s，1H)，5.31(d，J=2.4 Hz，1H)，2.66(s，1H)，2.19(s，24H)，1.38(s，3H)，0.91(d，J=6.9 Hz，6H)。 ESIMS[(p-cymene)Os(L)Cl]3+m/z：理論值 320.91，實(shí)測(cè)值321.33。元素分析按分子式OsC47H60N8Cl4·CH2Cl2計(jì)算，理論值(%)：C 49.96,H 5.41,N 9.71;實(shí)測(cè)值(%)：C 50.02；H 6.10；N 9.82。

1.2.2 配合物[(bip)Os(L)Cl]Cl3·2CH2Cl2·H2O(2)(L=(p-bitmb)2CH2)

配合物2的合成與1類似，將[(p-cymene)OsCl(μ-Cl)]2換成 [(bip)OsCl(μ-Cl)]2(0.012 5 mmol，10.4 mg)，烘箱溫度為100℃，其余條件不變。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ10.17(s,2H),8.35(d，J=1.4 Hz，4H),7.97(s，2H)，7.41～7.22(m，8H)，6.49(d，J=14.1 Hz，1H),6.40(d，J=14.1 Hz，1H)，6.29～6.20(m，4H)，5.74(t，J=5.0 Hz,1H),5.56(d,J=15.0 Hz,3H),5.39(dd，J=31.8,15.0 Hz,4H),5.21(d,J=15.0 Hz，2H)，2.19(s，24H)。 ESI-MS [(bip)Os(L)Cl]3+m/z：理論值 327.57，實(shí)測(cè)值327.92；{[(bip)Os(L)Cl]Cl}2+m/z：理論值 509.09，實(shí)測(cè)值 509.25；{[(bip)Os(L)Cl]Cl2}+m/z：理論值 1 053.63，實(shí)測(cè)值1 053.25。元素分析按分子式OsC49H56N8Cl4·2CH2Cl2·H2O 計(jì)算,理論值(%):C 47.97,H 4.89,N 8.78;實(shí)測(cè)值(%)：C 47.76，H 5.02，N 9.04。

1.3 X射線單晶結(jié)構(gòu)測(cè)定

選取大小為0.1mm×0.05mm×0.05mm配合物1的晶體置于單晶衍射儀上，以經(jīng)石墨單色器單色化的 Mo Kα 射線(λ=0.071 073 nm)做入射光源，以ω-2θ掃描方式在296 K下收集衍射點(diǎn)。采用SAINT和SADABS程序進(jìn)行吸收校正，晶體結(jié)構(gòu)經(jīng)過直接法解出。所有非H原子都經(jīng)過各向異性處理，晶體結(jié)構(gòu)通過使用OLEX2 1.2-beta內(nèi)的SHELXT[16]程序在F2上通過全矩陣最小二乘法進(jìn)行精修，由于有無序溶劑分子的存在，故采用squeeze對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的精修。晶體數(shù)據(jù)列于表1。

CCDC：1841765，1。

表1 配合物1的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data for 1

1.4 配合物的穩(wěn)定性研究

通過紫外光譜測(cè)定配合物1和2在緩沖溶液中的穩(wěn)定性(10 h)[14]。配制濃度為 200 μmol·L-1的配合物 1 和 2 溶液(VDMSO∶VPBS=5∶95)，用路徑為 1 cm 的石英比色皿，設(shè)置波長(zhǎng)間隔為1 nm，波長(zhǎng)范圍為200～600 nm，在室溫下每隔1 h記錄1次數(shù)據(jù)。

1.5 紫外滴定實(shí)驗(yàn)-研究配合物與CT-DNA的相互作用

配制2mmol·L-1配合物1和2的DMSO溶液，分別用 PBS 稀釋到濃度為 200 μmol·L-1(VDMSO∶VPBS=5∶95)。紫外滴定過程中保持配合物的濃度不變，用雙通道進(jìn)行測(cè)試(比色皿的體積為1 mL，厚度為1 cm)，即以PBS或者相應(yīng)濃度的DNA作為空白參照，加入等份的 CT-DNA(3.64 mmol·L-1)改變 DNA的濃度 (每次加1μL)混合均勻后靜置10min，在200～500 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)記錄吸光度值。

1.6 圓二色譜研究配合物對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響

配制濃度為 100μmol·L-1的 CT-DNA，固定DNA的濃度，配制不同比例的配合物溶液使ccomlex/cDNA的比例 r依次為 0、0.1、0.2、0.3、0.4，即配合物的濃度依次為 0、10、20、30、40 μmol·L-1，在 37 ℃下孵化24 h后進(jìn)行測(cè)試。

1.7 核磁共振研究亞甲基的來源

為了研究單晶結(jié)構(gòu)中亞甲基是否來源于溶劑二氯甲烷，我們將溶劑換成氘代二氯甲烷在相同條件下進(jìn)行溶劑熱反應(yīng),即以[(p-cymene)OsCl(μ-Cl)]2(0.012 5 mmol，9.8 mg)，1，4-二 (1-咪唑基-亞甲基)-2,3，5，6-四甲基苯(p-bitmb)(0.075mmol，23.52mg)為原料，加入2.5 mL的氘代二氯甲烷溶液，超聲2～5 min，放入裝有聚四氟乙烯的內(nèi)襯的反應(yīng)釜，在80℃的烘箱中反應(yīng)48 h。待冷卻到室溫以后，收集晶體，洗滌，真空干燥后在DMSO-d6中進(jìn)行核磁共振研究。

1.8 粘度法測(cè)試配合物與CT-DNA的相互作用

粘度用烏氏粘度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，保持溫度(25±0.1)℃。測(cè)試液配制方法：固定DNA的濃度，逐漸增加配合物濃度的方法配制。測(cè)試溶液的相對(duì)粘度用下列公式計(jì)算[17]：

其中t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，t為DNA溶液或者含不同濃度配合物的DNA溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需要的時(shí)間。 以(η/η0)1/3對(duì)比率 r(cEB/cDNA或ccomlex/cDNA)作圖，η0為未加配合物時(shí)DNA的相對(duì)粘度。

1.9 配合物的細(xì)胞毒性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)選取了3種細(xì)胞株：人卵巢癌細(xì)胞(A2780)，肺癌細(xì)胞(A549)和正常肝臟細(xì)胞(L02)。細(xì)胞在含10%的血清培養(yǎng)基RPMI1640(Gibco BRL)中37℃培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)方法：將細(xì)胞以5 000個(gè)每孔的初始密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在培養(yǎng)基中進(jìn)行培育24 h。加入100μL陰性和陽性對(duì)照以及不同濃度的配合物 (VDMSO∶V培養(yǎng)基=1∶99)， 在 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別向孔中加入20μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，然后孵化4 h，移除96孔板中的培養(yǎng)基，加入150μL的DMSO，利用酶標(biāo)儀(Infinite M200，Tecan，Mnnedorf，Switzerland) 在 590 nm的掃描波長(zhǎng)下測(cè)試其吸光度值，用SPSSinc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算得到配合物的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)

配合物1的晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要鍵長(zhǎng)和鍵角見表2。配合物1為一個(gè)單核鋨的結(jié)構(gòu)。中心鋨原子與2個(gè)p-bitmb配體上的氮原子以及氯原子進(jìn)行配位，形成了一個(gè)以芳基鋨為中心的配位端；pbitmb配體中另一端的咪唑環(huán)通過一個(gè)亞甲基進(jìn)行連接，形成了咪唑嗡離子的有機(jī)端。最終，配合物1形成一個(gè)類似“碗”狀的單核金屬環(huán)狀結(jié)構(gòu)。配合物1屬于單斜晶系，P21/c空間群。配合物1的空腔內(nèi)有一個(gè)氯離子(Cl2)與配體上的 C11、C28、C32、C47以及芳環(huán)中C2上的相應(yīng)氫原子形成氫鍵(表3)。配合物1的“碗狀”分子在空間上為兩種取向，形成了如圖1(c)所示的二維堆積。

圖1 (a)裝載有氯離子的類似“碗狀”的單核金屬環(huán)OsLCl(L=(p-bitmb)2CH2)配合物的單晶結(jié)構(gòu),(b)具有“碗狀”結(jié)構(gòu)的配合物1側(cè)面圖,(c)配合物1的二維堆積圖Fig.1 (a)X-ray crystal structure of the “bowl-like” mononuclear OsLCl(L=(p-bitmb)2CH2)metallamacrocycle 1 with a Cl-anion trapped inside the cavity;(b)Side view to show the trapped chloride anion inside the “bowl-like” structure of complex 1;(c)Packingmode of complex 1

表2 配合物1的部分鍵長(zhǎng)和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for 1

表3 配合物1的氫鍵數(shù)據(jù)Table 3 Hydrogen bond geometry of comp lex 1

2.2 核磁共振氫譜驗(yàn)證亞甲基的來源

為了驗(yàn)證單核金屬環(huán)OsLCl(L=(p-bitmb)2CH2)中橋連亞甲基的來源。我們用氘代二氯甲烷代替二氯甲烷，在相同條件下進(jìn)行溶劑熱反應(yīng)，即在80℃的烘箱中反應(yīng)48 h。待冷卻到室溫以后，收集晶體，洗滌，干燥樣品后進(jìn)行核磁檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，圖2(a)是以CD2Cl2為溶劑所得配合物的1H NMR，圖2(b)為以CH2Cl2為溶劑所得配合物1的1H NMR。以CH2Cl2為溶劑所得晶體的核磁結(jié)果顯示在δ6.449～6.223出現(xiàn)了2個(gè)分裂的峰(-CH2-)，這可能是由于合成的單核環(huán)狀配合物1結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性所導(dǎo)致的[18]。當(dāng)溶劑為氘代二氯甲烷時(shí)，在δ6.449～6.223處的峰消失。結(jié)果表明亞甲基來自于溶劑二氯甲烷。

圖2 以CD2Cl2(a)或CH2Cl2(b)為溶劑通過溶劑熱反應(yīng)得到配合物1的1H NMR譜Fig.2 1H NMR spectra of 1 in DMSO-d6 solution obtained from the solvothermal reaction in CD2Cl2(a)or CH2Cl2(b)

2.3 配合物的穩(wěn)定性研究

通過紫外光譜研究了配合物在DMSO/PBS溶液(VDMSO/VPBS=5∶95)中的穩(wěn)定性(圖 3)，配合物 1 的吸收峰出現(xiàn)在237和279 nm處，分別歸屬于配合物中金屬到配體的電荷躍遷(MLCT)以及配體內(nèi)部的電荷躍遷(IL)[19]。水解反應(yīng)10 h以后，配合物1的紫外吸收峰強(qiáng)度幾乎未發(fā)生變化。配合物2的吸收峰出現(xiàn)在235和287 nm處，分別歸屬于配合物的MLCT和IL躍遷。在10 h內(nèi)，配合物的最大吸峰強(qiáng)度幾位置未發(fā)生明顯變化。由上可知，配合物1和2在DMSO/PBS溶液中可以穩(wěn)定存在。

2.4 紫外滴定實(shí)驗(yàn)研究配合物與CT-DNA的相互作用

DNA是金屬抗癌藥的作用靶點(diǎn)之一，在配合物中加入DNA后會(huì)引起其紫外吸收強(qiáng)度的變化，使配合物出現(xiàn)增色或者減色現(xiàn)象[20-22]。從圖4可以看出，在200μmol·L-1的配合物中逐漸加入CT-DNA，配合物1和2的吸光度值都呈現(xiàn)增色效應(yīng)。

為了進(jìn)一步比較配合物與DNA作用的情況，在紫外滴定實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過Benesi-Hildebrand方程式計(jì)算配合物DNA的結(jié)合常數(shù)[23]：

圖3 配合物1和2在DMSO/PBS溶液中的紫外吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of complexes 1(a)and 2(b)in DMSO/PBSsolution

圖4 配合物1(a)和2(b)隨CT-DNA濃度增加的紫外吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of the complexes 1(a)and 2(b)in the absence and presence of increasing concentrations of CT-DNA

其中εa、εb、εf分別為配合物的表觀吸收系數(shù)，配合物完全結(jié)合DNA的吸收系數(shù)和純配合物的吸收系數(shù)。根據(jù)方程式線性擬合，通過斜率和截距來計(jì)算配合物的結(jié)合常數(shù)Kb。

根據(jù)Benesi-Hildebrand方程計(jì)算得到配合物1和2與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)，分別為3.22×104L·mol-1，1.53×104L·mol-1。配合物 1 與 CT-DNA 結(jié)合能力大于2的，與已經(jīng)報(bào)道的單核吡啶芳基鋨配合物與DNA作用的結(jié)合常數(shù)大致在同一數(shù)量級(jí)[24]。

2.5 圓二色譜研究配合物對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜常用來研究配合物與DNA的相互作用，一般B型DNA較為常見，其正吸收峰出現(xiàn)在275 nm附近，與DNA的堿基堆積有關(guān)；負(fù)峰出現(xiàn)在245 nm附近，與DNA的右手螺旋性質(zhì)有關(guān)[25]。圖5為配合物1和2與CT-DNA相互作用的圓二色譜圖。配合物1和2的變化趨勢(shì)相似，即隨著配合物濃度的增大，DNA在275 nm處的正峰信號(hào)減弱，說明加入配合物影響了CT-DNA的堿基堆積作用，并且CT-DNA的負(fù)峰強(qiáng)度(245 nm附近的峰強(qiáng)度)隨著配合物濃度的增大而下降。對(duì)配合物1而言，當(dāng)r=0.2時(shí)，CT-DNA信號(hào)峰值接近與0，說明1對(duì)DNA的堿基堆積和右手螺旋性質(zhì)產(chǎn)生較大的影響。對(duì)于配合物2而言，當(dāng)r=0.4時(shí)，CT-DNA的負(fù)峰接近于0，說明配合物2也影響了DNA的右手螺旋性質(zhì)。上述結(jié)果表明，配合物均可以與DNA發(fā)生相互作用，減弱DNA的堿基堆積作用并對(duì)DNA的右手螺旋性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.6 粘度法測(cè)試配合物與CT-DNA的相互作用

圖5 配合物1(a)、2(b)與CT-DNA相互作用的圓二色譜圖Fig.5 CD spectra of CT-DNA in the absence and presence of complexes 1(a)or 2(b)

粘度測(cè)試是研究配合物與DNA作用方式的方法之一。配合物與CT-DNA以嵌入方式相互作用時(shí)，DNA雙螺旋鏈增長(zhǎng)，DNA粘度增大；以部分插入的方式作用時(shí)，DNA溶液的粘度降低；以靜電或溝面方式作用時(shí)，DNA溶液的粘度未發(fā)生明顯變化[26]。溴化乙錠(EB)是典型的DNA嵌入劑，與DNA發(fā)生作用時(shí)會(huì)使其粘度增加。由圖6可知，隨配合物1、2濃度的增加，DNA的粘度呈增加的趨勢(shì)，類似于EB，結(jié)果表明配合物以嵌入的方式與DNA結(jié)合。

圖 6 EB(■)、配合物1(●)和 2(▲)濃度的增加對(duì) DNA粘度的影響Fig.6 Effecton the relative viscosity of CT-DNA after addition of increasing amounts of ethidium bromide(■),1(●)and 2(▲)in PBS

2.7 配合物的細(xì)胞毒性

采用MTT法研究了配合物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)、肺癌細(xì)胞(A549)以及正常的肝臟細(xì)胞(L02)的細(xì)胞毒性。配合物的IC50結(jié)果表明，配合物1和2對(duì)癌細(xì)胞A2780、A549和正常細(xì)胞L02基本沒有毒性，其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于順鉑。

表4 配合物1和2的IC50Table 4 IC50 of com plexes 1 and 2 μmol·L-1

3 結(jié) 論

合成、表征了2種“碗狀”單核芳基金屬鋨配合物。配合物的單晶結(jié)構(gòu)表明芳基鋨的Osギ與2個(gè)配體的咪唑氮原子以及氯原子配位，2個(gè)配體的另一個(gè)咪唑基團(tuán)通過一個(gè)亞甲基碳原子連接形成咪唑嗡離子。在氘代試劑中合成配合物并通過核磁共振方法證實(shí)橋聯(lián)亞甲基基團(tuán)來自于溶劑二氯甲烷。配合物在緩沖溶液中可以穩(wěn)定存在，并以嵌入的方式與DNA相互作用，影響DNA的螺旋性質(zhì)及堿基堆積作用。本研究為合成同時(shí)具有配位端及咪唑嗡離子端的配合物提供了一個(gè)方法。