水溶性銅卟啉配合物的合成、與DNA的相互作用及抗腫瘤活性

哈斯其美格 陳麗華 肖朝虎

(西北民族大學實驗中心，蘭州 730030)

0 引 言

自順鉑作為抗癌藥物問世后，金屬配合物與DNA相互作用的研究一直是生物無機化學的重要課題[1-4]。最早用于治療癌癥和艾滋病的藥物是一些通過與DNA結合進而干擾DNA復制、轉錄與表達的藥物，且藥物與DNA的作用機制有利于藥物設計的靶向性[5]。因此，設計合成活性較高、毒副作用較低的抗腫瘤藥物分子，關鍵在于研究藥物分子與DNA的相互作用。通過研究藥物分子與DNA相互作用，有利于了解藥物作用機理，進行藥物體外篩選，以及利用藥物構效關系進行藥物結構改造，設計活性更高、毒副作用更低的新藥物分子。

卟啉及金屬卟啉類化合物是一種重要而特殊的物質，具有獨特的生物活性。如光合作用中的關鍵物質葉綠素(含鎂的卟啉化合物)、促進骨髓造血的血紅素(含鐵的卟啉化合物)等都廣泛存在于自然界和生物體中[6]。近年來，卟啉類化合物因其結構的特異性，被廣泛的應用于各個領域如醫學、生物化學、材料化學等，尤其是其醫學方面的研究已成為當今的熱門課題，涉及的領域包括如研發抗病毒試劑、DNA/RNA選擇性切割試劑、端鏈酶抑制劑及研究DNA足跡法、DNA/RNA雜交的穩定等[7-9]；又如利用其光敏性、實現光動學治療或利用其對腫瘤細胞的特殊親和性和選擇性富集的特點，實現抗腫瘤作用等[10-13]。但由于卟啉化合物具有較大的剛性空間構型，其在水中的溶解度幾乎為零，這大大限制了卟啉化合物在醫學方面的應用。而吡啶基、磺酸基、氨基、羧基等大極性基團具有良好的水溶性，可以通過將卟啉環與大極性基團結合在一起，獲得相應的水溶性卟啉及金屬卟啉[14-17]。水溶性卟啉及金屬卟啉被認為是具有“雙重作用”的化合物，其原因在于水溶性卟啉化合物一方面能與帶有負電荷的水溶性DNA穩定結合，另一方面可利用其光活性裂解DNA。因此，對水溶性卟啉及金屬卟啉與DNA相互作用及其抗腫瘤活性的研究，將有助于更深入了解DNA的結構和功能，有助于水溶性卟啉及金屬卟啉在醫學上的應用，如PDT、癌癥檢測、人造核酸酶、抑制病毒等[18-20]；對認識很多疾病的治療機制和藥物的設計也起到非常重要的作用。

本文合成了3種A3B型水溶性含溴銅卟啉(CuP-1)及其溴取代衍生物(CuP-2、CuP-3)，并對其結構進行了表征。采用紫外光譜法、EB-DNA熒光淬滅法、粘度法以及圓二色譜法等光譜手段研究了它們與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用。采用噻唑蘭(MTT)法，以人成纖維細胞為正常細胞系，評價了CuP-1、CuP-2和CuP-3在不同濃度、不同作用時間下，對宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MDA)2種腫瘤細胞株的抗腫瘤活性。以期為研究和開發療效更高、毒副作用小的具有抗腫瘤活性的卟啉類藥物提供一定的實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所用試劑均為分析純，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)使用前用CaH2回流除水，然后減壓蒸餾備用。吡咯使用前重蒸。除非另有說明，其余試劑在使用前均不做任何處理。CT-DNA購自Sigma公司，溴化乙錠(EB)，三羥甲基甲胺(Tris)等均購自上海生工生物工程公司。胎牛血清購自GIBCO公司，DEME購自Hyclone公司。

儀器包括核磁共振儀 (MERCRY Plus 400)、質譜儀(Bruker Esquire 6000)、紫外光譜儀(UV-2550)、熒光光譜儀(RF-5301PC)、粘度計(UbbeloMe)、圓二色譜儀(J-810)、CO2培養箱(Thermo)、酶標儀(THERMO MultisKan FC)等。

1.2 合成及表征

1.2.1 5，10，15-三(4-吡啶)-20-(4-對溴)苯基卟啉的合成

稱取1.85 g(0.01mol)對溴苯甲醛于500 mL三口燒瓶中，加入150mL丙酸，加熱并攪拌。當油浴溫度達到130℃左右時，快速加入2.7mL(0.03mol)4-吡啶甲醛，再用滴液漏斗緩慢滴加溶解在10mL丙酸中的新蒸吡咯2.6 mL(0.04 mol)，10 min內加完。溶液逐漸變為棕黑色，保持高速攪拌，140℃繼續回流2 h。反應結束，減壓蒸餾，蒸去丙酸，得到深紫色的粗產物。將深紫色粗產物溶于二氯甲烷中，用飽和碳酸氫鈉中和，有機相以無水硫酸鈉干燥，濃縮。用硅膠(200～300目)作固定相，二氯甲烷和石油醚混合液(1∶1，V/V)作流動相，不同體積比的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液做洗脫劑進行柱層析分離純化，收集第 5色帶，減壓旋蒸，真空干燥，即得紫色目標產物 5，10，15-三(4-吡啶)-20-(4-對溴)苯基卟啉，產率：4%。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.99(d，6H)，8.79～8.60(m，8H)，8.19(m，6H)，8.07(m，2H)，7.83(d，2H),-3.00(s,2H)。質譜 m/z：698.331 0,[M+H]+。 元素 分 析 按 C41H26BrN7計 算 值 (%)：C，70.69% ；H，3.76%；N，14.08%。 實驗值(%)：C，70.63%；H，3.78%；N，13.98%。

1.2.2 CuP-1的合成

稱取 100mg(0.14mmol)5，10，15-三(4-吡啶)-20-(4-對溴)苯基卟啉于50mL三口燒瓶中，加入5 mL無水DMF，磁力攪拌使其溶解。氬氣保護、避光的條件下，將1 mL碘甲烷(過量)加到上述溶液中，繼續避光、通氮氣，40℃加熱攪拌反應3 h。反應完畢停止加熱，冷卻至室溫，緩慢滴加丙酮，析出沉淀、過濾，濾餅反復用三氯甲烷洗滌、真空干燥，得到5，10，15-三甲基吡啶基-20-(4-對溴)苯基卟啉，產率：89%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ9.51(s，6H)，9.01(m，12H)，8.09(m，2H)，7.83(d，2H)，4.59(s，8H)，-3.00(s，2H)。 質譜 m/z：742.060 7，[M-3I]+。元素分析按C44H35BrI3N7計 算 值 (%)：C，47.08% ；H，3.14% ；N，8.74%。實驗值(%)：C，47.05%；H，3.16%；N，8.75%。

稱取 100 mg(0.13 mmol)5，10，15-三甲基吡啶基-20-(4-對溴)苯基卟啉溶于5 mL無水DMF中，加入3 mL溶有89 mg(0.52 mmol)氯化銅的無水甲醇溶液，65℃攪拌反應5 h。反應完畢，減壓蒸去甲醇，滴加丙酮，析出沉淀、過濾，濾餅反復用三氯甲烷洗滌、真空干燥,得到目標產物CuP-1，產率：75%。1H NMR(600 MHz，DMSO) δ9.32(m，6H)，8.09(m，6H)，7.27～7.55(m，4H)，6.68(d，2H)，4.50(s，5H)，3.56(s，9H)。ESI-MS：質譜 m/z：803.033 4，[M-3Cl]+。 元素分析 按 C44H33BrCl3CuN7計 算 值 (%)：C，58.10% ；H，3.66%；N，10.78%。 實驗值(%)：C，58.03%；H，3.70%；N，10.88%。UV-Vis(Tris-HCl buffer，pH=7.2)λmax/nm(absorbance)=424.5(1.579)，549.5(0.198)，584(0.09)。

圖1 CuP-1、CuP-2及CuP-3的合成路線Fig.1 Synthesis routes for CuP-1,CuP-2 and CuP-3

1.2.3 CuP-2或CuP-3的合成

氬氣保護下，將100 mg(0.13 mmol)CuP-1溶于30mL無水DMF中，依次加入33mg(0.2mmol)咔唑或 29 mg(0.2 mmol)2-(咪唑-2-基)吡啶，84 mg(0.26 mmol)碳酸銫，5 mg(0.026 mmol)碘化亞銅和5.5 mg(0.13mmol)無水氯化鋰，于140℃回流反應72 h。反應結束，冷卻至室溫，滴加三氯甲烷，析出沉淀、過濾，濾餅反復用三氯甲烷洗滌、真空干燥，得到目標產物 CuP-2或 CuP-3，產率：43%(CuP-2)或 37%(CuP-3)。

CuP-2：1H NMR(600MHz，DMSO)δ9.12(m，6H)，8.30(m，6H)，8.06 ～7.10(m，6H)，4.49(s，6H)，3.30(s，9H)。 質譜 m/z：888.293 6，[M-3Cl]+。 元素分析按C56H41Cl3CuN8計算值 (%)：C，67.54%；H，4.15%；N，11.25%。實驗值(%)：C,67.61%；H，4.09%；N，11.23%。UV-Vis(Tris-HCl buffer，pH=7.2)λmax/nm(absorbance)=422.5(1.491)，546.5(0.182)，628.5(0.12)。

CuP-3：1H NMR(600MHz，DMSO)δ9.18(m，6H)，8.30(m，6H)，7.93(s，3H)，4.49(s，6H)，3.30(s，9H)。質譜m/z:866.124 4,[M-3Cl]+。元素分析按C52H40Cl3CuN10計算值(%)：C，64.07%；H，4.14%；N，14.37%。 實驗值(%)：C，64.09%；H，4.13%；N，14.36%。 UV-Vis(Tris-HCl buffer,pH=7.2)λmax/nm(absorbance)=433.5(1.405),564.5(0.108)，628.5(0.076)。

1.3 配合物與DNA相互作用的實驗

CT-DNA 溶液用緩沖溶液(5 mmol·L-1Tri-HCl，50 mmol·L-1NaCl，pH=7.2)配制，測其 A260/A280=1.8～1.9，說明該DNA溶液基本上不含蛋白質[21]，不需要進一步處理。CT-DNA的濃度根據其在260 nm處的摩爾消光系數值(6 600 L·mol-1·cm-1)來計算[22]。 配合物的溶液用稱量法進行配制。

1.3.1 紫外光譜滴定實驗

室溫下，參比池中加入3.0 mL Tris-HCl(pH=7.20)緩沖溶液，樣品池中加入3.0 mL待測樣品，用微量進樣器每隔5 min向樣品池中加入2μL 1.0 mmol CT-DNA并攪拌，直到紫外吸收值恒定不變。每次加CT-DNA前檢測其在200～700 nm范圍內的紫外可見吸收光譜。待測樣品與CT-DNA相互作用的結合常數(Kb)由下面公式計算得到：

其中，εa代表存在不同濃度的CT-DNA時待測樣品的摩爾消光系數；εf為不存在CT-DNA時待測樣品的摩爾消光系數；εb為待測樣品與CT-DNA作用達到平衡時的摩爾消光系數。以cDNA/(εa-εf)為縱坐標，cDNA為橫坐標作圖，得到一條直線，待測樣品的結合常數(Kb)即為這條直線斜率與截距的比值。

1.3.2 EB-DNA淬滅實驗

恒定室溫下，熒光池中加入2.5mL Tris-HCl緩沖溶液和20μL EB，然后滴加4μmol·L-1CT-DNA直到熒光強度不再變化即達到滴定平衡(λex=496 nm，λem=596 nm)。每隔5 min，用微量進樣器滴加0.2 mL待測樣品直到熒光強度不再下降即達到滴定平衡。根據Stern-Volmer方程[23]計算熒光淬滅常數(Ksv)：

其中，F0代表不存在待測樣品時的熒光強度；F代表存在待測樣品時的熒光強度；cQ代表淬滅劑的濃度；Ksv代表動態淬滅常數。

1.3.3 粘度實驗

在(25.00±0.01)℃恒定溫度條件下，首先將10 mL Tris-HCl(pH=7.20)緩沖溶液加入到粘度計中，測量溶液流經毛細管所用的時間為t0；接著將50μL配制的CT-DNA溶液加入其中，混勻后，測量溶液流經毛細管所需的時間t；每隔5 min，滴加待測樣品2.5μL，混勻后，測量待測樣品加入后CT-DNA粘度的變化；停止測量，直至流動時間基本不發生變化。此操作重復 3 次。以(η/η0)1/3為縱坐標，待測樣品與CT-DNA濃度比為橫坐標作圖，觀察CT-DNA相對粘度變化[24]。

其中η0代表不存在待測樣品時CT-DNA粘度值，η代表存在待測樣品時CT-DNA粘度值。

1.3.4 圓二色譜實驗

首先將1 mL Tris-HCl(pH=7.20)緩沖液加到比色池中，掃描其在220～500 nm范圍內的CD光譜作為對照，然后將 10μmol·L-1待測樣品和50μmol·L-1CT-DNA溶液混合，混勻、反應 5 min，在 220～500 nm范圍內測定待測樣品的ICD光譜。

1.4 抗腫瘤活性實驗

人成纖維細胞(L929)、宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MDA)均由蘭州大學醫學院提供。取宮頸癌細胞 (Hela)、乳腺癌細胞(MDA)和人成纖維細胞(L929)(處于對數生長期)，用DMEM培養基(含有10%胎牛血清)配制單細胞懸浮液，濃度約為4×104mL-1。然后接種于96孔板中。每孔加入的細胞懸液為100μL，需要注意的是配制單細胞懸液時盡量保持加入每孔的細胞數一致。

將細胞培養至貼壁再分組，分為4組進行實驗，對照組(con)為不加藥組，加入DMEM培養基(含有10% 胎牛血清 )；其余各組為實驗組(exp)，各實驗組分別加入100μL的含CuP-1～CuP-3的濃度分別為 25、50、75 及 100 μmol·L-1的溶液。 每組設 3個實驗孔、3個復孔。37℃、5%(V/V)CO2，水蒸氣飽和培養條件下，分別繼續培養24，48和72 h，以僅含有10%胎牛血清DEME培養基，不接種細胞的空白組為調零孔。

培養終止，分別向每孔中加入10μLMTT溶液(5 mg·mL-1)，原條件下繼續培養4 h，培養終止后，棄上清液，加二甲基亞砜(DMSO)(200μL)到每孔，然后以中速于水平搖床上振蕩15min，檢測570 nm吸光度OD值。重復3次實驗，計算細胞抑制率(Rin)公式如下：

其中ODexp為實驗組OD值，ODcon為對照組OD值。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜滴定實驗

卟啉類化合物的結構中由于存在共軛大環結構，而具有紫外可見吸收特征光譜，在Soret帶有一個強吸收峰而在Q帶有3～4個弱的吸收峰[25]。因此紫外-可見光譜常被用來研究卟啉類化合物與DNA的相互作用[26]。

如圖2所示，水溶性銅卟啉配合物CuP-1、CuP-2和 CuP-3的 Soret帶分別位于 424.5、422.5和433.5 nm。隨著滴加CT-DNA濃度的遞增，CuP-1、CuP-2和CuP-3 Soret帶的吸收強度都出現明顯降低，且分別紅移到430.5、426.5和439 nm。其中CuP-1的Soret帶減色41.5%，紅移6 nm。而相同條件下，CuP-2和CuP-3的Soret帶分別減色25.4%和26.4%，且分別紅移了4 nm和5.5 nm。研究結果顯示，CuP-1、CuP-2和CuP-3 Soret帶的紫外吸收均出現紅移及減色現象，說明DNA堿基的π共軛體系與CuP-1、CuP-2和CuP-3的大環π*共軛體系發生了某種作用，致使π電子堆積，π電子軌道和π*空軌道發生耦合，促使π→π*躍遷能降低，表現為紅移。減色效應是因為耦合作用促使π*軌道部分充滿電子，減小了π→π*躍遷，吸收峰強度因此降低。初步判斷CuP-1與CT-DNA可能以插入結合的方式作用，而CuP-2和CuP-3與CT-DNA是以外部溝面結合的方式作用。為了定量比較CuP-1、CuP-2和CuP-3與CT-DNA結合能力的強弱，根據Soret帶吸光度值隨著CT-DNA濃度的變化進行紫外光譜滴定，測定配合物與CT-DNA的結合常數。如表1所示，本實驗條件下，CuP-1、CuP-2和 CuP-3與CTDNA 的結合常數 Kb分別為 1.622×105、1.004×105和1.143×105L·mol-1。說明 CuP-1、CuP-2 和 CuP-3 與DNA結合能力的大小為CuP-1＞CuP-3＞CuP-2。

圖2 CT-DNA對CuP-1(a)、CuP-2(b)和CuP-3(c)紫外可見吸收光譜的影響;(d)結合常數的測定Fig.2 Influence of CT-DNA on the absorption spectra of CuP-1(a),CuP-2(b)and CuP-3(c);(d)Determination of binding constant

2.2 EB-熒光淬滅法

熒光光譜是研究化合物與DNA相互作用的主要手段之一，由于Cuギ離子的3d軌道有單電子存在，具有順磁性，所以水溶性銅卟啉配合物CuP-1、CuP-2和CuP-3這3種金屬配位的卟啉化合物均沒有熒光，與文獻[27]報道一致。

EB分子本身的熒光很弱，但若存在DNA時，EB分子能夠迅速插入到DNA堿基對中并發出很強的熒光。原因在于EB分子插入到DNA堿基對中后，受到DNA疏水環境的保護，避免了EB分子激發態與水分子之間由于發生能量交換而產生的非輻射猝滅。而對于本身沒有熒光的化合物而言，化合物的加入若使EB-DNA體系的熒光明顯降低，認為該化合物與EB發生了DNA競爭結合，EB-DNA體系熒光降低的程度就成為化合物與DNA結合能力的間接體現[28]。

如圖3所示，EB-DNA體系隨CuP-1、CuP-2和CuP-3的滴加，EB-DNA體系的熒光光譜均發生不同程度的熒光淬滅現象，表明這些配合物與CTDNA之間存在一定的相互作用。其中，隨滴加的CuP-1濃度的遞增，EB-DNA體系的熒光強度淬滅現象最為明顯，EB-DNA體系的熒光強度逐漸減弱，最后幾乎被完全猝滅，表明可能有部分EB分子已被CuP-1從EB-DNA體系中取代出來，發生了與EB分子類似的插入作用。另外，根據Stern-Volmer方程和熒光淬滅常數曲線得出CuP-1、CuP-2和CuP-3 的淬滅常數， 分別為 1.303×104、8.62×103和1.032×104L·mol-1(表 1)。 這3種陽離子卟啉化合物的Stern-Volmer淬滅常數呈現 CuP-1＞CuP-3＞CuP-2的趨勢。淬滅常數的這種次序能反映出這些淬滅劑與CT-DNA的結合能力。熒光淬滅實驗所反映的水溶性卟啉配合物與CT-DNA結合能力的次序與紫外光譜實驗結果基本一致。

圖3 CuP-1(a)、CuP-2(b)和CuP-3(c)對EB-DNA體系熒光光譜的影響及Stern-Volmer方程的線性擬合Fig.3 Influence of CuP-1(a),CuP-2(b)and CuP-3(c)on the fluorescence spectra of EB-DNA and Linear fitting of the Stern-Volmer equation(d)

表 1 CuP-1、CuP-2和CuP-3與CT-DNA結合的參數Table 1 Parameters of CuP-1,CuP-2 and CuP-3 in binding w ith CT-DNA

2.3 粘度法研究

化合物與DNA是否發生相互作用可通過光譜學數據充分反映出來，但不能充分說明化合物與DNA的作用方式。研究化合物與DNA相互作用的實驗方法中最有說服力的是粘度法[29]。當某種化合物與DNA以插入的方式進行相互作用時，這種化合物會插入到DNA相鄰堿基對中，致使相鄰堿基對的距離變長，進而增加DNA鏈的相對長度，表現為DNA相對粘度升高。而當化合物與DNA以部分插入或非經典的插入方式進行作用時，DNA相鄰堿基對發生扭結，DNA鏈的相對長度變短，表現為DNA相對粘度降低。當DNA相對粘度沒有明顯變化時，說明化合物與DNA以外部溝面結合的方式進行作用。

水溶性銅卟啉配合物 CuP-1、CuP-2和 CuP-3滴加到CT-DNA體系(pH 7.20，TrisHCl緩沖液)后對CT-DNA相對粘度的影響，如圖4所示。當CuP-1滴加到CT-DNA體系后，隨濃度比率r(r=ccomplex/cDNA)的遞增，CT-DNA溶液的粘度呈明顯的上升趨勢。表明CuP-1可能以插入模式與CT-DNA進行作用。而CuP-2和 CuP-3滴加到CT-DNA體系后，CT-DNA溶液的粘度沒有明顯的變化，說明這2種配合物可能以外部溝面結合的方式與CT-DNA進行作用。

圖4 CuP-1、CuP-2和CuP-3對CT-DNA相對粘度的影響Fig.4 Influence of CuP-1,CuP-2 and CuP-3 on the relative viscosity of CT-DNA

2.4 圓二色譜法研究

通常研究卟啉類化合物與DNA相互作用最直接的方法是圓二色譜法(CD)。具有不對稱結構的卟啉化合物在Soret帶沒有CD信號，當DNA與這種卟啉化合物發生相互作用時會在Soret帶產生誘導CD(ICD)信號峰。因此卟啉類化合物與DNA不同的作用模式對應不同的誘導CD(ICD)信號峰。一般認為，負的ICD信號峰，表示卟啉類化合物與DNA以插入的方式相互作用；正的ICD信號峰，表示卟啉類化合物與DNA以外部溝面結合方式相互作用；等強的正、負ICD信號峰，表示卟啉類化合物與DNA以外部堆積的方式相互作用[30-31]。

為進一步證實 CuP-1、CuP-2和 CuP-3與 CTDNA的結合模式，采用CD光譜在220～500 nm的波長范圍內研究其與CT-DNA的結合模式。如圖5所示，當 配合物與DNA的濃度比r(r=ccomplex/cDNA)為0.05時，CuP-1在433 nm處出現1個較強的負峰，而CuP-2和CuP-3在431和430 nm處各出現1個正峰。這表明CuP-1與CT-DNA以插入的模式進行作用，而CuP-2和CuP-3通過外部溝面結合的方式與CT-DNA進行作用。

圖5 CT-DNA存在時CuP-1、CuP-2和CuP-3的誘導圓二色光譜Fig.5 ICD spectra of CuP-1,CuP-2 and CuP-3 in the presence of CT-DNA

以上結果表明CuP-1與CT-DNA以插入的模式進行相互作用，而CuP-2和CuP-3通過外部溝面結合的方式與CT-DNA進行相互作用，且CuP-1與CT-DNA的結合能力優于CuP-2和CuP-3。可能的原因在于CuP-1的空間構型及體積相對于CuP-2和CuP-3較小，且趨于平面，利于其嵌入到DNA的堿基對中成鍵，與CT-DNA以插入的模式進行結合。CuP-2和CuP-3結構中由于芳香環上存在N雜環取代基，會使CuP-2和CuP-3與DNA結合時產生較大的空間位阻，因此CuP-2和CuP-3易從外部與CT-DNA分子進行鍵合，與CT-DNA以外部溝面結合的模式進行作用。且CuP-2和CuP-3結構中芳香環上N雜環取代基含有帶孤電子對的N原子，影響復合物的穩定性，進而影響CuP-2和CuP-3與CT-DNA的結合效果。

2.5 M TT法測定CuP-1～CuP-3對腫瘤細胞增殖的影響

基于水溶性銅卟啉配合物CuP-1～CuP-3與CTDNA以不同的結合模式進行相互作用，以及卟啉類化合物對腫瘤細胞良好的靶向作用及其結構的特異性[32]，本文以人成纖維細胞(L929)為正常細胞系，以宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MDA)為測試細胞株，考察了CuP-1～CuP-3的體外抗腫瘤活性。

不同濃度、不同作用時間的條件下，CuP-1～CuP-3對Hela和MDA的抑制率如圖6～8所示。結果表明，隨濃度和作用時間的增大，CuP-1～CuP-3對Hela和MDA的抑制率呈現時間和劑量依賴性，其中CuP-1對2種腫瘤細胞的抑制率明顯高于其溴取代衍生物CuP-2和CuP-3。通常，利用化合物的半數有效濃度IC50來評價其藥效，IC50值越小表明其藥效越好。如表2所示，CuP-1對Hela和MDA分別作用 24、48、72 h 后的 IC50值分別為：59.399、42.513和 33.956 μmol·L-1以及 107.094、60.215 和 46.406 μmol·L-1；可知在相同條件下，CuP-1 對 Hela 的體外增殖抑制作用優于MDA，且作用72 h時其抑制率最高，說明CuP-1對Hela可能具有特定的靶向性。而CuP-2和CuP-3對Hela和 MDA分別作用 24、48、72 h 后的 IC50值均大于 119 μmol·L-1(表 2)，表明CuP-2和CuP-3對2種腫瘤細胞的體外增殖抑制作用相對于CuP-1的抑制作用較弱，可能與其和CT-DNA的作用模式有關。另外，從表2中可知，CuP-1～CuP-3對L929的抑制率均很弱，其可能的原因在于卟啉環對腫瘤細胞的選擇性[33]。

圖6 CuP-1對2種腫瘤細胞的增殖抑制作用Fig.6 Proliferation inhibition of CuP-1 on two kinds of tumor cell lines

圖7 CuP-2對2種腫瘤細胞的增殖抑制作用Fig.7 Proliferation inhibition of CuP-2 on two kinds of tumor cell lines

圖8 CuP-3對2種腫瘤細胞的增殖抑制作用Fig.8 Proliferation inhibition of CuP-3 on two kinds of tumor cell lines

表 2 CuP-1～CuP-3 的 IC50值Table 2 IC50 values of CuP-1～CuP-3

3 結 論

基于A4型吡啶基陽離子卟啉具有與DNA強的插入作用及潛在的抗癌活性，合成了A3B型含溴的吡啶基陽離子銅卟啉CuP-1，進而通過官能團修飾，取代溴原子合成了其衍生物CuP-2和CuP-3，并進行了結構表征。采用紫外光譜法、EB-熒光淬滅法、粘度法和圓二色譜法研究了它們與CT-DNA的相互作用。結果表明，CuP-1與CT-DNA以插入的模式進行作用，而CuP-2和CuP-3與CT-DNA以外部溝面結合的方式進行作用，且CuP-1與CT-DNA的結合能力優于CuP-2和CuP-3。基于卟啉類化合物對腫瘤細胞良好的靶向作用及其結構的特異性，研究了CuP-1～CuP-3的體外抗腫瘤活性。實驗結果表明，CuP-1～CuP-3對Hela和MDA均有體外抑制腫瘤細胞增殖的作用，呈時間、劑量依賴關系。其中CuP-1對2種腫瘤細胞的體外增殖抑制作用遠遠優于其溴取代衍生物CuP-2和CuP-3，可能和CuP-1與DNA相互作用較強及結合模式有關，表明配合物與DNA的插入作用模式可能是配合物具有抗腫瘤活性的原因之一。且CuP-1對Hela的抑制增殖作用明顯優于MDA，表明CuP-1對Hela具有特定的靶向性，說明卟啉類化合物對腫瘤細胞存在靶向性篩選。