白竭散對肛瘺術后創面血管生成的調控機制研究

方笑麗，鄧 恒，王建民

(安徽中醫藥大學第一附屬醫院肛腸三科，安徽 合肥 230031)

肛瘺又稱肛管直腸瘺，是肛管直腸周圍間隙化膿性感染破潰形成的瘺，是一種常見的肛門直腸疾病。肛瘺發病率呈逐年上升趨勢，發病多為青年人群，發病率約為5%[1]。至今手術仍是肛瘺最有效的治療手段，然而由于肛門特殊的生理功能和解剖結構，術后創面愈合往往較慢，且易發生感染、瘢痕增生等，使病情遷延[2]。因此，肛瘺術后創面的愈合是近年來醫學研究的熱點。創面修復過程復雜，與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules, PECAM-1/CD31)及第Ⅷ因子關聯抗原(von willebrand factor, VWF)表達水平密切相關[3]。前期研究發現，白竭散可通過增加肛瘺術后創面羥脯氨酸含量促進創面愈合[4]，但對創面血管生成的影響尚未闡明。因此，本研究通過白竭散對肛瘺術后創面的干預，觀察其對VEGF、CD31、VWF蛋白表達的影響。

1 臨床資料

1.1 診斷標準 符合《中醫病證診斷療效標準》[5]肛瘺診斷標準。

1.2 納入標準 符合診斷標準，且自愿接受本治療并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 排除合并肝病、腎病、代謝性疾病、嚴重的神經缺損等嚴重疾病者，妊娠期、哺乳期或正準備妊娠的婦女，對多種藥物過敏等過敏體質者，未滿觀察期而中斷治療、無法判斷療效或資料不全者，以及其他難以對其有效性和安全性做出確切評價者。

1.4 一般資料 選取2014年11月至2016年5月就診于安徽中醫藥大學第一附屬醫院的75例肛瘺患者，將其隨機分為白竭散組、貝復濟組、對照組，每組25例。其中白竭散組男14例，女11例，平均年齡(40.47±8.45)歲；貝復濟組男15例，女10例，平均年齡(38.92±10.25)歲；對照組男13例，女12例，平均年齡(39.85±9.19)歲。3組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 方法

2.1 治療方法 3組患者均行術前備皮、術晨清潔灌腸，全部病例均采用腰椎麻醉，采用肛瘺切除術，切口均不縫合，檢査創面無活動性出血后，用凡士林油紗條填塞，塔形紗布壓迫，大敷貼固定。術后酌情運用抗生素，保持大便通暢，每日便后用痔瘺洗劑坐浴，術后第2天開始每日便后用痔瘺洗劑坐浴、換藥，直至創面愈合。

白竭散組：每日便后坐浴，患者取側臥位，生理鹽水棉球清洗創面，拭干后每平方厘米用2 g白竭散均勻撒于4 cm×2 cm大小的凡士林紗條上，填塞切口，無菌敷料外敷，膠布固定，直至痊愈。

貝復濟組：同法清理創面，每平方厘米用貝復濟150 Au噴涂于創面，然后用浸有貝復濟的紗條填塞切口，無菌敷料外敷，膠布固定，直至痊愈。

對照組：同法清理創面，用4 cm ×2 cm 大小的凡士林填塞切口，無菌敷料外敷，膠布固定，直至痊愈。換藥時注意切口引流情況及創面情況。

2.2 指標觀察

2.2.1 毛細血管計數 術后7、14 d，分別觀察創面新鮮肉芽組織，10%甲醛固定48 h，常規脫水，石蠟包埋，作4 μm連續切片，將石蠟切片按常規脫蠟至水，蘇木精染色5 min，自來水沖洗至無色；1%鹽酸乙醇分化，去除過度染色部分，伊紅染色2 min，蒸餾水清洗3次；常規梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，自然晾干后，進行光鏡觀察。

2.2.2 免疫組織化學法觀察VEGF、CD31及VWF表達水平 分別取術后7、14 d創面新鮮肉芽組織，10%甲醛固定48 h，常規脫水，石蠟包埋，作4 μm連續切片，將石蠟切片按常規脫蠟至水，抗原熱修復，阻斷內生過氧化物酶后，滴加一抗工作液，4 ℃過夜，復溫0.5～1 h，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。滴加兔二步法二抗工作液，37 ℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色液顯色，蘇木精復染3 min，1%鹽酸乙醇脫色20 s，PBS返藍，二甲苯透明，最后樹膠封固。

2.2.3 Western blot法檢測VEGF、CD31、VWF蛋白表達水平 分別取術后7、14 d創面新鮮肉芽組織，剪碎，RIPA組織裂解液裂解，吸取勻漿后，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，提取總蛋白。用BCA法測蛋白濃度。取蛋白20 μg作電泳，將蛋白樣本轉移至尼龍濾膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉4 h，TBST洗3次，每次10 min，分別加入抗VEGF、CD31、VWF多克隆抗體，4 ℃過夜。分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，脫色搖床搖1.5 h，TBST洗3 次，每次10 min。以β-actin作為內參。凝膠成像系統拍照，并掃描分析各條帶的光密度，以β-actin的表達量為對照計算各組VEGF、CD31、VWF的相對表達量。

3 結果

3.1 3組創面毛細血管數比較 術后7、14 d，貝復濟組和白竭散組創面毛細血管數均較對照組明顯增加(P<0.05)，白竭散組創面毛細血管數明顯多于貝復濟組(P<0.05)；術后14 d，3組創面毛細血管數較術后7 d明顯增加(P<0.05)。結果提示白竭散可促進肛瘺患者術后創面毛細血管新生，效果優于貝復濟。見表1和圖1。

表1 3組創面毛細血管數比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05；與術后7 d比較，△P<0.05

圖1 3組創面毛細血管數(蘇木精-伊紅染色，10×20倍)

3.2 3組患者創面VEGF表達水平比較 免疫組織化學法檢測結果顯示，與對照組比較，貝復濟組和白竭散組的VEGF在胞漿內呈大量棕黃色顆粒，數量明顯增多。Western blot法檢測結果顯示，術后7、14 d，貝復濟組、白竭散組較對照組創面VEGF表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；術后14 d，白竭散組VEGF表達水平明顯高于貝復濟組(P<0.05)。見圖2、圖3。

3.3 3組患者創面CD31表達水平比較 免疫組織化學法檢測結果顯示，與對照組比較，貝復濟組和白竭散組的CD31在胞漿內呈大量棕褐色顆粒，數量明顯增多。Western blot法檢測結果顯示，術后7、14 d，與對照組比較，貝復濟組、白竭散組創面CD31表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；白竭散組較貝復濟組CD31表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、圖5。

圖2 3組術后7、14 d創面VEGF表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05

圖4 3組術后7、14 d創面CD31表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05

3.4 3組患者創面VWF表達水平比較 免疫組織化學法檢測結果顯示，與對照組比較，貝復濟組和白竭散組的VWF在胞漿內呈大量棕褐色顆粒，數量明顯增多。術后7、14 d，貝復濟組、白竭散組創面VWF表達水平較對照組顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與貝復濟組比較，白竭散組創面VWF表達量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6、圖7。

圖6 3組術后7、14 d創面VWF表達水平

4 討論

肛瘺術后創面愈合的過程是內皮細胞、成纖維細胞增殖分化，纖維蛋白合成、重組，新生血管的形成以及表皮細胞增生覆蓋創面的過程。影響肛瘺術后創面愈合的因素主要有營養狀況、基礎疾病、生活習慣、局部感染、缺血、創面異物等[6]。創面愈合過程中血管內皮細胞經過生芽、遷移、增殖、基質重塑等過程，逐漸形成新毛細血管。血管新生對創面愈合起著至關重要的作用。創面毛細血管數目多、血運豐富，可有效提高創面部分新陳代謝的速度，同時還可降低毛細血管的脆弱性，提高組織氧供，促進傷口愈合[7]。血管內皮細胞的激活是血管新生的首要步驟。術后創面可刺激各種細胞因子，活化血管內皮細胞，刺激VEGF、CD31、VWF等表達增加，激活創面修復。

注：與對照組比較，*P<0.05；與貝復濟組比較，#P<0.05

白及為蘭科多年生草本植物白及的干燥塊莖，具有收斂止血、消腫生肌的功效，可用于外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等。彭銳等[8]研究發現，白及通過促進創面肉芽組織、毛細血管生長及創面組織VEGF生成，促進創面愈合。白及同時具有抗炎、鎮痛作用，誘導免疫調節因子的表達，加強對細菌、異物的吞噬作用，促進釋放各種生長因子，以利于創面愈合[9-10]。

龍血竭是劍葉龍血樹樹干產生的紅色樹脂，具有活血化瘀、消腫止痛、止血補血、斂瘡生肌之效。李曉蘭等[11]研究發現，龍血竭可明顯縮短肛瘺術后創面愈合時間,且無瘢痕過度生長。李丹等[12]研究發現，血竭乙酸乙酯提取物可促進成纖維細胞增殖，減少Ⅲ型前膠原表達，從而促進創面愈合，又不致于過度增生而形成病理性瘢痕。朱頡等[13]研究發現，血竭殼聚糖藥膜可通過活化Wnt/β-catenin信號通路，促進創面β-catenin、VEGF、Cyclin D1蛋白及其mRNA的表達，從而促進創面愈合。

白竭散由白及和血竭配伍組方，前期研究發現，白竭散可通過提高創面羥脯氨酸含量促進肛瘺患者術后創面愈合[4]。本研究發現，在肛瘺術后創面修復的過程中，白竭散組創面局部毛細血管數量顯著高于貝復濟組和對照組。VEGF作為一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，可以通過與內皮細胞上的受體與內皮細胞高親和力結合，一方面直接刺激血管內皮細胞增殖，誘導其遷移和形成管腔樣結構；另一方面增加微血管通透性，引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)外滲，并通過誘導間質產生而促進體內新生血管生成[14]。本研究發現，術后7、14 d白竭散組創面VEGF蛋白表達水平較對照組及貝復濟組顯著增加，白竭散在創面愈合過程中能夠更有效促進創面VEGF的表達，從而促進創面新生血管的生長，加速肉芽生長，促進創面愈合。CD31是內皮細胞上介導細胞間黏附的整合素蛋白，作為一種新型的微血管標記物，對新生血管內皮細胞的標記的特異性很強，并參與血管新生過程，在顯示血管內皮細胞時的特異性優于其他的內皮細胞標記物[15]。VWF是血管內皮細胞特異性標志之一。血中VWF主要由內皮細胞合成，也可來源于巨核細胞和血小板，血管內皮細胞和血管受損時，細胞內VWF含量明顯降低而血中含量增加，并與血小板協同對血管損傷起修補作用[16]。近年來研究發現，VWF可激活整合素ανβ3促進血管新生[17]。本研究顯示，白竭散組術后7、14 d創面CD31、VWF蛋白表達水平較貝復濟組和對照組顯著增加，表明白竭散可顯著加速創面新生血管生成，改善局部微循環，增加局部血流，有效地加快創面的愈合速度，提高創面愈合質量。

本研究表明，白竭散在肛瘺術后創面修復過程中對血管生成的促進作用優于貝復濟，白竭散主要通過促進創面肉芽組織中VEGF、CD31、VWF蛋白表達，增加創面新生毛細血管的生成，改善術后創面局部缺血、缺氧狀態，促進創面愈合。