基于超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術研究苦參醇提物致大鼠肝毒性的尿液代謝組

姜 鵬，孫言才，蔡 穎，王欣晨

(中國科學技術大學附屬第一醫院西區 安徽省腫瘤醫院藥劑科，安徽 合肥 230031)

苦參(Sophoraflavescens)為豆科槐屬植物苦參的干燥根，始載于《神農本草經》，為常用的中藥，臨床上主要用于治療各種肝炎、癌癥、病毒性心肌炎、胃腸出血和皮膚病[1]。大量中藥產品中都含有苦參，例如消銀片、苦參片、當歸苦參丸、濕毒清膠囊和痔血膠囊等。其中痔血膠囊由于其嚴重的肝毒性被國家食品藥品監督管理局召回[2-3]，前期研究發現苦參是痔血膠囊中產生肝毒性的藥物[4]，但苦參引起的肝毒性機制尚不清楚。一般而言，臨床上苦參多用水煎液，苦參水提物主要含苦參堿和氧化苦參堿等生物堿類成分，具有保肝作用；而苦參醇提物主要含有苦參酮和槐屬二輕黃酮G等異戊烯基黃酮類成分[4]，是苦參主要的肝毒性成分，許多中藥制劑含有苦參的醇提物，其臨床用藥帶來的風險不容忽視。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后迅速發展起來的組學技術，是機體面對內源性和外源性化合物后體內所有代謝物的變化輪廓，是研究復雜系統的一種重要研究工具[5]。代謝組學與其他組學相比，數據處理相對簡單，取樣(主要為尿液和血液)方便，對機體沒有侵入性，可以對機體進行動態觀察，反映實際的毒性作用，在化合物的毒性篩選、臨床前和臨床藥物的毒性評價和作用機制研究方面有著廣泛應用[6-8]。對于中藥這種復雜的系統，代謝組學在研究中藥的作用或毒性機制方面有著明顯優勢[9-10]。目前，代謝組學常用的分析方法主要包括質譜技術、核磁共振檢測技術和色譜-質譜聯用技術等，尤其是超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS)具有檢測速度快、靈敏度高、能選擇性定性和定量檢測多種代謝物的特點，為代謝組學研究提供了有力的工具。本課題組前期已經開展了苦參干預后大鼠的血清代謝組學研究[11]，大鼠灌胃給予苦參醇提物(Sophora flavescens alcohol extract，SFAE)14 d后，肝臟病理檢查和血清生化指標均表明大鼠產生明顯的肝毒性，在此基礎上，利用UPLC-HRMS技術，檢測大鼠灌胃給藥SFAE 14 d后尿液中代謝物的變化，并結合模式識別分析，尋找潛在的生物標志物，揭示SFAE給藥前后內源性代謝物的變化趨勢，探討SFAE產生作用的代謝通路，為研究SFAE的肝毒性機制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 UPLC-LTQ-Orbitrap system色譜-質譜聯用儀：德國Thermo公司；XS105DU型電子天平：美國Mettler Toledo公司；QT-1型渦旋混合器：上海琪特分析儀器有限公司；1730R型冷凍離心機：丹麥Scan Speed公司；Millipore Milli-Q純水機。

1.2 試劑 苦參：上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆化B氮化鈉：上海國藥集團化學試劑有限公司；對照品焦谷氨酸、去氧膽酸、肌酸、卡馬西平、膽酸、甘氨膽酸和霉酚酸：均購于美國Sigma公司；甘氨酸、酮戊二酸、丙酮酸、脯氨酸、琥珀酸和檸檬酸：均購于上海源葉生物科技有限公司；色譜純甲醇、乙腈：購于韓國Burdick & Jackson公司；甲酸(批號 FS0830-15)：美國Tedia公司。

2 方法

2.1 SFAE的制備 根據實驗室前期報道的方法[4]制備苦參粉末。稱取苦參干燥根，采用70%乙醇回流提取法提取2次，每次提取4 h，將所得濃縮液合并過濾后再旋蒸濃縮，所得膏狀藥物在70 ℃經真空干燥得SFAE，1 g SFAE相當于20 g生藥量。

2.2 動物分組及給藥 雄性清潔級SD大鼠，體質量(200±20)g，購于上海必凱實驗動物有限公司[生產許可證號為SCXK(滬)2013-0016]，由復旦大學藥學院動物實驗中心提供。自由攝食飲水，適應性飼養1周，12 h明暗循環。實驗前12 h禁食，自由飲水。

取18只SD大鼠隨機分為3組，每組6只，對照組給予1%吐溫80溶液；SFAE低劑量組(1.25 g/kg相當于臨床常用劑量的25倍)、高劑量組分別稱取12.5、25 g SFAE，用200 mL 1%吐溫80制成混懸液，給藥前充分振搖均勻。各組動物每天灌胃給藥1次，灌胃容積均為20 mL/kg，連續給藥14 d。

2.3 大鼠尿液采集 大鼠分別單獨置于代謝籠中，將加入0.2%疊氮化鈉的玻璃試管置于冰上，收集末次給藥后12 h大鼠尿液，將收集的尿液以4 000×g離心10 min，取上清液存于-80 ℃冰箱備用。

2.4 尿樣的制備 將尿液用超純水稀釋20倍后精密吸取50 μL，加入250 μL含內標的甲醇(卡馬西平60 ng/mL，霉酚酸700 ng/mL)，渦旋混勻5 min，在4 ℃條件下，16 000 r/min高速離心10 min，取上清液進樣5 μL分析。

2.5 色譜和質譜條件

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動相：0.1%甲酸/水(A)和乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90% A；1.0～2.0 min，90%→60% A；2.0～11.0 min，60%→40% A；11.0～14.0 min，40%→10% A；14.0～15.0 min，10% A；15.0～15.5 min，10%→90% A；15.5～20.0 min，90% A。流速：0.3 mL/min。柱溫：35 ℃。自動進樣器溫度：4 ℃。進樣量：5 μL。

2.5.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI)；正、負離子分別監測模式；輔助氣流速：15單位；鞘氣流速：45單位；噴霧電壓：正極為3.8 kV，負極為-3.2 kV；毛細管溫度：350 ℃；加熱部件溫度：300 ℃；掃描范圍為m/z50～1 000。

2.6 數據處理與分析 采用儀器配套軟件SIEVE進行色譜峰提取和峰匹配，所得的數據輸出到Excel表中進行預處理。將預處理得到的數據導入SIMCA-P 13.0軟件進行無監督識別模式識別方法——主成分分析(principal components analysis, PCA)和有監督模式識別方法——正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)。OPLS-DA模型中得到變量的投影重要性(variable importance in projection，VIP)值，可評價不同變量與分類的相關程度，如果VIP值>1，表明該變量對分類的貢獻比較大，以VIP>1為標準篩選變量。此外，對于篩選變量進行Kruskal-WallisH檢驗，只有同時滿足VIP>1和P<0.05的變量才被認為是差異有統計學意義的變量。將篩選得到的差異有統計學意義的變量通過保留時間、加合離子信息、精確分子量和對照品比對，同時檢索HMDB(http://www.hmdb.ca)、KEGG(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)、Metlin(http://metlin.scripps.edu)等數據庫，鑒定差異代謝物的結構并構建代謝通路。

2.7 方法學考察 從所有尿液樣本中取等容積的尿液，混勻得到尿液質控(quality control, QC)樣本。將QC樣本與尿液樣本按照同樣的方法進行處理，并在進樣時每隔3個尿液樣本插入1個QC樣本。通過觀察QC樣本在PCA得分圖上的聚集度，考察分析方法的穩定性。

3 結果

3.1 大鼠尿液代謝物輪廓分析 采用軟件SIEVE進行色譜峰提取和峰匹配，比較3組樣本負離子和正離子的典型基峰色譜圖(見圖1)，發現組間色譜峰存在明顯差異，特別是負離子檢測模式下，4～10 min內峰形、峰強和峰位變化顯著，初步說明大鼠給予不同劑量苦參后，對照組和給藥組尿液代謝物輪廓發生顯著改變。

3.2 大鼠尿液代謝組PCA和OPLS-DA分析 將經過預處理后數據導入SIMCA-P軟件進行多變量統計分析，采用PCA和OPLS-DA對對照組和給藥組尿液代謝物的LC-MS數據進行分析。PCA得分圖(圖2A、圖2B)顯示，在正、負離子模式下，QC樣本聚集程度高，且可與其他各組樣本區分，說明樣本前處理及分析方法穩定可靠；對照組和給藥組尿液代謝物能夠被明顯區分開，說明給予SFAE后大鼠體內環境出現顯著變化。OPLS-DA得分圖(圖2C、圖2D、圖2E、圖2F)顯示，在正、負離子模式下，對照組和SFAE低劑量組、對照組與SFAE高劑量組間區分明顯，模型參數R2X>0.8，R2Y>0.9，Q2>0.9，說明模型穩定、可靠，預測能力高，提示組間代謝輪廓譜存在明顯差異。

圖1 大鼠尿液的LC-MS基峰色譜圖(m/z 50～1 000)

注：A.R2X=0.829，Q2=0.751；B.R2X=0.851，Q2=0.814；C.R2X=0.963，R2Y=0.997，Q2=0.966；D.R2X=0.955，R2Y=0.998，Q2=0.972；E.R2X=0.884，R2Y=0.999，Q2=0.994；F.R2X=0.905，R2Y=0.999，Q2=0.991

圖2大鼠尿液LC-MS分析數據的PCA得分圖(A、B)和OPLS-DA得分圖(C、D、E、F)

3.3 差異代謝物的篩選與鑒定 對SFAE低劑量組和對照組、SFAE高劑量組和對照組的LC-MS數據進行OPLS-DA分析，分別計算各差異變量的VIP值。經篩選鑒定，對照組與給藥組比較，共有15個差異有統計學意義的代謝物，其中6個正離子模式差異性代謝物和9個負離子模式差異性代謝物，見表2。對篩選鑒定的顯著差異性代謝物，借助代謝組學綜合處理軟件Metaboanalyst 3.0結合HMDB、KEGG、Lipidmaps等數據庫，分析其參與的生理生化過程，主要涉及以下代謝通路：能量代謝、膽汁酸代謝和氨基酸代謝，見表2。

4 討論

三羧酸循環是需氧生物體普遍存在的能量代謝過程[12]，它既是氨基酸、糖類和脂類的最終代謝通路，又是這三大營養素代謝聯系的樞紐。琥珀酸、檸檬酸和酮戊二酸均為三羧酸循環的重要中間產物，大鼠給予苦參后，尿液中琥珀酸和檸檬酸的表達水平顯著升高，酮戊二酸的表達水平降低，提示SFAE影響三羧酸循環的能量產生過程。

肝臟是氨基酸代謝的主要場所，任何肝臟損傷都可能導致氨基酸代謝紊亂，脯氨酸和甘氨酸在尿中的水平明顯升高，提示SFAE干擾氨基酸代謝通路。膽汁酸是膽固醇的代謝產物，主要分為初級膽汁酸和次級膽汁酸，初級膽汁酸在肝內以膽固醇為原料而生成，又在腸道中合成一系列次級膽汁酸[13]，其水平變化會直接影響膽汁池的動態平衡，從而誘發膽汁淤積和肝臟損傷，研究表明膽汁酸內穩態失衡是許多藥物引起肝臟損傷共同的過程[14]，膽酸、甘氨膽酸和脫氧膽酸在尿中水平明顯升高，提示SFAE干擾膽汁酸代謝。

表2 SFAE給藥組和對照組大鼠尿液差異性代謝物的鑒定結果

注：升高或者降低表示與對照組相比的代謝物變化水平

馬尿酸通常是芳香類化合物攝入體內后，在肝臟通過與氨基酸(如甘氨酸)反應轉化而成[15]，其表達水平升高提示給藥組大鼠肝臟可能受到損傷。N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸是賴氨酸的甲基化衍生物，是左旋肉毒堿和脂肪酸氧化輔酶的前體物質[16]，與左旋肉毒堿的合成有關，N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸在尿液中的水平升高提示肉毒堿合成和脂肪酸氧化輔酶的原料增加，可能是機體增加肉毒堿合成的代償機制。焦谷氨酸是谷氨酸的環化衍生物，與谷胱甘肽代謝有關，尿中焦谷氨酸水平升高提示谷胱甘肽的消耗增加。肌酸是氨基酸的衍生物，主要利用精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸在肝內合成，能夠為肌肉和神經細胞提供能量。研究表明肝臟損傷時肌酸水平會顯著升高[17]。給藥組大鼠尿液中肌酸水平明顯高于對照組，說明SFAE造成了肝臟毒性。

綜上所述，本研究采用UPLC-HRMS技術對灌胃給予SFAE 14 d后的大鼠尿液進行代謝組學研究。運用PCA和OPLS-DA等模式識別方法進行分析，共篩選和鑒定出15個主要的差異代謝物，相關代謝通路分析結果表明SFAE主要影響肝臟的三羧酸循環、膽汁酸代謝和氨基酸代謝等代謝過程。本研究為深入探討SFAE的肝毒性機制奠定了一定的實驗基礎。