丹參治療股骨頭壞死的分子機(jī)制研究

閻博昭，李 剛，許 波，李嘉程，夏聰敏，梁學(xué)振，駱 帝

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東 濟(jì)南 250355)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)病程長、致殘率高且臨床常見。相關(guān)資料顯示，目前中國ONFH患者例數(shù)為500萬～750萬，每年新增患者7萬～15萬[1]。各類原因?qū)е碌墓晒穷^血液供應(yīng)不足、骨細(xì)胞損害造成的骨壞死是當(dāng)前ONFH發(fā)病的主流認(rèn)知[2-3]。本病早期若不能及時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，將會(huì)導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變甚至塌陷等嚴(yán)重后果，大大降低患者的生活質(zhì)量。目前，治療ONFH的公認(rèn)藥物主要包括雙膦酸鹽類藥物、降脂類藥物、抗凝藥物、血管擴(kuò)張藥物、參與氧化應(yīng)激類藥物、參與骨代謝藥物等[4]。上述藥物雖然可以改善臨床癥狀，但存在靶向性單一、療效不確切等問題，而中醫(yī)藥憑借其辨證論治而達(dá)到精準(zhǔn)治療的優(yōu)勢(shì)便凸顯出來了。

在運(yùn)用中醫(yī)藥防治股骨頭壞死的長期臨床觀察基礎(chǔ)之上，筆者發(fā)現(xiàn)“瘀”和“虛”兩大要素始終貫穿該病始末，“瘀”即血瘀痰阻、經(jīng)絡(luò)阻滯；而“虛”即肝腎虧虛、氣血不足。“虛”為本而“瘀”為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)之證是為該病的病機(jī)，因此，運(yùn)用“補(bǔ)腎活血”為思路，以丹參為主遣方用藥，可獲顯著療效。一味丹參，功同四物，其水溶性成分和脂溶性成分是其重要活性成分[5]。丹參具有增進(jìn)組織修復(fù)與再生、加速骨質(zhì)形成、抗血栓、調(diào)節(jié)微循環(huán)、抗氧化以及鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等作用[6]。但現(xiàn)有研究未就其分子機(jī)制作出清晰的闡釋，需要利用科學(xué)的方法加以研究和闡述。因此，我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，通過篩選和預(yù)測(cè)丹參和ONFH中符合要求已公開報(bào)道的相關(guān)靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)富集分析得出信號(hào)通路，以探討丹參可能的分子機(jī)制。見圖1。

1 方法

1.1 丹參藥物成分篩選及成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP；http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[7]進(jìn)行丹參藥物成分挖掘。并根據(jù)成分藥物代謝動(dòng)力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)[8-10]參數(shù)進(jìn)行選擇，其標(biāo)準(zhǔn)[11-12]為：藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。通過TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)上述入血活性成分的作用靶點(diǎn)，基于網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.2.1(http：//www.cytoscape.org)[13]對(duì)活性成分及作用靶點(diǎn)生成網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并分析網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)，得到丹參中重要成分靶點(diǎn)。

圖1 丹參治療股骨頭壞死的分子機(jī)制分析流程圖

1.2 檢索已知的ONFH相關(guān)疾病靶點(diǎn) 檢索藥物銀行(DrugBank；https://www.drugbank.ca)、藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)知識(shí)庫(pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB；https://www.pharmgkb.org)、人類表型數(shù)據(jù)庫(the human phenotype ontology，HPO；http://human-phenotype-ontology.github.io)、遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(the genetic association database，GAD；https://geneticassociationdb.nih.gov)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM；http://www.omim.org)、疾病-基因網(wǎng)絡(luò)集合數(shù)據(jù)庫(disease-gene net，DisGeNET；http://www.disgenet.org)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD；http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)等與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，篩選后獲得目前已知的ONFH發(fā)病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 為了直觀地呈現(xiàn)藥物有效成分和靶點(diǎn)之間的調(diào)控關(guān)系，利用Cytoscape軟件中的BisoGenet插件對(duì)上述獲得的丹參入血活性成分及ONFH靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)繪制，而BisoGenet是由生物數(shù)據(jù)交互庫(biological general repository for interaction datasets，BioGRID；https://thebiogrid.org/)、生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(biomolecular interaction network database，BIND；https://www.isc.org/downloads/bind/)、分子相互作用數(shù)據(jù)庫(molecular interaction database，MINT；http://cbm.bio.uniroma2.it/mint/index.html)、人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫(human protein reference database，HPRD；http://www.hprd.org)、相互作用蛋白數(shù)據(jù)庫(database of interacting proteins，DIP；http://dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi)和開源分子相互作用數(shù)據(jù)庫(IntAct數(shù)據(jù)庫；https://www.ebi.ac.uk/intact)共6個(gè)不同的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫工具。隨后將2個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖融合并抽取交集網(wǎng)絡(luò)，即可得到丹參治療ONFH的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA (http://apps.cytoscape.org/apps/cytonca)[14]對(duì)上述操作所得交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯M(jìn)一步呈現(xiàn)所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)借助以下指標(biāo)：度中心性(degree centrality，DC)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)，特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality，NC)和局部邊連通性(local average connectivity，LAC)等。

1.4 信號(hào)通路富集分析 上述步驟取得關(guān)鍵靶點(diǎn)后，以通路富集分析插件ClueGO(http://www.ici.upmc.fr/cluego/cluegoDownload.shtml)[15]進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，可視化展現(xiàn)結(jié)果并繪制信號(hào)通路占比餅狀圖。通過結(jié)果進(jìn)一步分析丹參治療ONFH的可能作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 丹參活性成分篩選與ADME分析 本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到丹參已被報(bào)道的所有成分202個(gè)，根據(jù)OB和DL等ADME參數(shù)篩選到入血活性成分65個(gè)，其篩選的成分分布圖見圖2。

注：OB為藥物口服生物利用度，DL為類藥性

圖2根據(jù)ADME參數(shù)篩選出的丹參入血活性成分分布圖

2.2 丹參作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建分析 本研究利用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)技術(shù)對(duì)上述活性成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，排除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)103個(gè)；利用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape 3.2.1對(duì)上述入血活性成分及預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的繪制和分析可知，丹參發(fā)揮重要作用的入血活性成分與對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)的相互關(guān)系共1 348個(gè)，如圖3所示。

2.3 ONFH相關(guān)靶點(diǎn)檢索分析 本研究通過檢索目前國際公認(rèn)的7個(gè)疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，并搜集前期研究和報(bào)道，共獲得與ONFH發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的已知的相關(guān)靶點(diǎn)基因74個(gè)，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB、DisGeNET、HPO數(shù)據(jù)庫分別檢索到0、0、3、46、34、14、1個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 丹參治療ONFH的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選分析

2.4.1 丹參治療ONFH的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 本研究通過BisoGenet對(duì)丹參入血活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)與其產(chǎn)生直接或間接作用的靶點(diǎn)共有5 896個(gè)，而這些靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系多達(dá)131 478個(gè)。與此同時(shí)，對(duì)ONFH相關(guān)的靶點(diǎn)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)與其直接或者間接相關(guān)的靶點(diǎn)多達(dá)2 002個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相互關(guān)系有51 792個(gè)。

2.4.2 丹參治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選分析 本研究通過Cytoscape 3.2.1對(duì)上述繪制的2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)圖抽取交集網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)采用CytoNCA工具(https://omictools.com/cytonca-tool)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵傩院Y選，共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)130個(gè)。篩選策略示意圖見圖4。

2.5 丹參治療ONFH的機(jī)制分析 本研究利用ClueGO對(duì)上述130個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示，丹參作用于ONFH的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)主要涉及75條信號(hào)通路，例如促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成和抑制破骨細(xì)胞的骨吸收信號(hào)通路，見圖5。

3 討論

ONFH病情遷延難愈，致殘率高，最終骨組織結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，下肢力學(xué)性能發(fā)生改變。西醫(yī)認(rèn)為ONFH的發(fā)病機(jī)制是脂類代謝紊亂、骨內(nèi)高壓、血管內(nèi)凝血、二次碰撞等[16]。而中醫(yī)學(xué)則認(rèn)為，ONFH的病機(jī)是外邪侵襲，痹組經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢，加之先天腎氣不足，正虛邪戀[17]。《宣明論方》曾指出：“夫痛者，經(jīng)脈流行不止，環(huán)周不休，寒氣入經(jīng)而稽遲，血泣凝而不行，客于脈外血少；客于脈中氣不通，故卒然而痛。”因此，“氣滯血瘀，脈絡(luò)瘀阻”是導(dǎo)致患肢疼痛的關(guān)鍵因素之一。本課題組在臨床根據(jù)該病的辨證分期，以“補(bǔ)腎活血”為治療思路，遣方用藥中活血藥不離始終，均取得滿意的效果[18-19]。

注：圖中菱形代表丹參最終入血活性成分；圓形分別代表靶點(diǎn)基因名；連線代表丹參入血活性成分與對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)的相互關(guān)系

圖3丹參“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

注：圖中nodes代表靶點(diǎn)；edges代表靶點(diǎn)間相互關(guān)系；箭頭代表拓?fù)浜Y選的步驟。DC(degree centrality)：借助度中心性；BC(betweenness centrality)：介度中心性；CC(closeness centrality)：接近中心性；EC(eigenvector centrality)：特征向量中心性；NC(network centrality)：網(wǎng)絡(luò)中心性；LAC(local average connectivity)：局部邊連通性

圖4丹參關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的目標(biāo)篩選策略圖

注：A.ClueGO信號(hào)通路顯著富集網(wǎng)絡(luò)圖；B.ClueGO富集分析餅狀圖

丹參作為臨床經(jīng)典的活血化瘀中藥，走血分而通血脈。《神農(nóng)本草經(jīng)》首載，味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[20]。胡海等[21]通過文獻(xiàn)挖掘并篩選發(fā)現(xiàn)活血化瘀藥和補(bǔ)虛藥是中醫(yī)藥治療ONFH的兩大類常用藥，而丹參在活血化瘀藥中的出現(xiàn)頻率為50.6%，可見其重要性。其治療股骨頭壞死的療效已被大量實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究證實(shí)。瓦慶德等[22]通過復(fù)制激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型，觀察兔破骨細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)丹參骨髓腔內(nèi)注射可抑制破骨細(xì)胞生成，對(duì)早期激素性股骨頭缺血性壞死有預(yù)防作用。李曉明等[23]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)丹參的有效成分之一丹參酮ⅡA可以改善股骨頭缺血區(qū)組織的側(cè)支循環(huán)，糾正缺血組織的代謝紊亂，有利于骨組織再生。本研究通過篩選獲得丹參中入血的活性成分65個(gè)，并在此基礎(chǔ)上挖掘出103個(gè)可能的靶點(diǎn)和1 348個(gè)相互關(guān)系。“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析顯示，丹酚酸、鼠尾酮、次丹參酮、毛地黃黃酮、黃芩苷等有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)靶點(diǎn)，MMP2、NCOA2、IL2等靶點(diǎn)也能與多個(gè)成分形成作用關(guān)系。由此可知，丹參藥物的各個(gè)有效成分與其作用靶點(diǎn)對(duì)疾病的進(jìn)展起著至關(guān)重要的作用。

從通路富集結(jié)果分析可知，丹參主要通過影響Wnt、NF-κB、HIF-1、MAPK、Notch、PI3K-Akt等多條與ONFH密切相關(guān)的信號(hào)通路而發(fā)揮其治療作用[24]，而這些關(guān)鍵通路可以分為兩大類：促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成作用與抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用。①促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成作用相關(guān)通路。Wnt信號(hào)通路可以調(diào)控骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)成骨，抑制成脂[25]。Shi等[26]在MC3T3-E1骨祖細(xì)胞系增殖分化的不同階段進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)Wnt通路組分表達(dá)與成骨細(xì)胞的分化呈正相關(guān)。MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)而參與細(xì)胞生理過程，在成骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。丁道芳等[28]通過觀察MAPK-ERK1/2信號(hào)通路的激活或抑制對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)此通路與成骨細(xì)胞增殖與基因表達(dá)顯著相關(guān)。HIF-1信號(hào)通路能夠適應(yīng)機(jī)體缺氧環(huán)境，調(diào)控骨形成及血管生成。鄒多宏等[29]通過基因工程技術(shù)試驗(yàn)證明HIF1ɑ能夠明顯上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨與成血管因子的表達(dá)。②抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用相關(guān)通路。NF-κB信號(hào)通路是大多數(shù)生物活性物質(zhì)介導(dǎo)骨吸收的最終和共有通路。NF-κB受體活化因子配基直接影響破骨細(xì)胞的分化及功能[30]。Notch信號(hào)通路通過上調(diào)Jagged1和Notch2可抑制骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化[31]。有研究表明，PI3K/Akt通路參與調(diào)控抑制破骨細(xì)胞生成[32]。

綜上，丹參通過多種關(guān)鍵信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的細(xì)胞生理過程，進(jìn)而達(dá)到防治ONFH的作用。此外，丹參作用靶點(diǎn)富集分析結(jié)果還顯示，網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了炎癥、免疫、DNA復(fù)制、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、EB病毒感染等相關(guān)信號(hào)通路，各靶點(diǎn)及信號(hào)通路之間存在較為復(fù)雜的相互關(guān)系，也揭示了中藥多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)理論和技術(shù)，旨在揭示活血中藥丹參治療ONFH的可能作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究指明方向。隨著研究技術(shù)及理論水平的不斷發(fā)展，中藥及其復(fù)方治療ONFH的分子機(jī)制將會(huì)得到進(jìn)一步闡明，中醫(yī)中藥必將會(huì)在諸如ONFH等難治性骨病中發(fā)揮不可替代的作用。