野生延胡索塊莖組織結構與生物堿組織化學定位

鐘意欣禾，胡 珂，彭華勝，彭代銀

(安徽中醫藥大學藥學院 安徽省道地中藥材品質提升協同創新中心，安徽 合肥 230012)

中藥延胡索為罌粟科多年生植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的干燥塊莖[1]，自唐代起就有其入藥的相關記載。如今使用的延胡索多產于浙江，在陜西漢中等地也有大面積的引種栽培[2]。延胡索塊莖主要含生物堿，可分為原小檗堿類、阿樸啡類、原阿片堿類、異喹啉苯并菲啶類等[3]。現代藥理學研究發現，這些生物堿能作用于神經系統、心血管系統，起到鎮痛、降低嗎啡成癮性、保護心肌細胞、抗心律失常、抗血栓等多種作用。本研究通過對栽培延胡索的基原植物——生延胡索進行適時跟蹤采集，觀察不同時期其塊莖各部分組織的生長規律及生物堿的分布狀況，以期為今后促進延胡索有效生物堿成分的積累提供依據。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料 2016年11月至2017年4月，每月在安徽省合肥市大蜀山北坡采集一年及多年生野生延胡索新鮮塊莖，經安徽中醫藥大學胡珂教授鑒定為罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的塊莖。

1.2 儀器 旋轉型石蠟切片機(Leica RM2265)：德國；烘干機；烘片機(Leica HI1220)：上海徠卡儀器有限公司；光學顯微鏡(Olypus BH2)；冰凍切片機(Leica CM1850UV)；熒光顯微鏡(Olympus BX51)；顯微攝像儀。

1.3 試劑 FAA固定液(70%乙醇-冰醋酸-甲醛，18∶1∶1)：上海聚泰特種試劑有限公司；濃度梯度乙醇(分析純)、濃度梯度二甲苯(分析純)：上海潤捷化學試劑有限公司；石蠟；藏紅T、固綠：上海源葉生物科技有限公司；中性樹膠；膠水。

2 方法

2.1 延胡索塊莖石蠟切片的制作與觀察 于2016年11月至2017年4月每月在大蜀山挖取一年生及多年生延胡索塊莖若干，帶土轉移至實驗室后用FAA固定液固定。常規制作石蠟切片后置光學顯微鏡下觀察、拍攝照片并記錄。

2.2 延胡索塊莖冰凍切片的制作與觀察 冰凍切片的冷凍溫度和冷凍時間對切片質量有很大的影響[4]，因此在經過一系列嘗試后最終以冷凍箱溫度-18 ℃、冷凍15 min為條件，切25 μm的薄片后直接放于熒光顯微鏡下觀察，拍攝照片并記錄。

2.3 陰性對照 將切好的延胡索薄片用酸性醇溶液處理洗脫其中的生物堿后，放在熒光顯微鏡下觀察，拍攝照片并記錄。

3 結果

3.1 多年生塊莖的組織結構變化 延胡索多年生塊莖的地下形態在休眠期為結實飽滿的球形，直至3月份地上部分開花期間，塊莖外部質地變得松泡，內部產生飽滿的新生塊莖。其顯微結構類似于莖的初生構造，從外向內分別為木栓層、皮層薄壁組織、形成層以及髓。沒有明顯的木栓形成層，且形成層處產生“生長點”，若產生一個以上的生長點則呈對稱分布。“生長點”于1月份開始經2～3個月分生擴大成新的塊莖，其以外的薄壁組織淀粉粒減少，纖維化成為頹廢組織。見圖1。

3.2 一年生塊莖的組織結構變化 延胡索一年生塊莖可以由種子直接發育形成，或由多年生塊莖的地下橫走莖節處膨大產生。前者為未充分發育的塊莖結構[5]，后者由于其產生位置處會形成一個凹痕，在野生條件下比較容易區分，因此用于制作石蠟切片。結果顯示其顯微結構與多年生塊莖相似，只是形成層常成不規則狀。見圖2。

3.3 延胡索塊莖生物堿分布規律 熒光顯微鏡下可見延胡索的新鮮冰凍切片除形成層外幾乎所有部分都發黃綠色熒光。其中靠近木栓層部分的皮層薄壁組織熒光強度要高于其他部分。新生塊莖的皮層薄壁組織亮度也較高。一年生塊莖的凹陷處木栓化細胞呈現不同的黃色。在塊莖出現松泡后，破碎的薄壁細胞也呈現亮黃綠色熒光。陰性對照顯示在洗去生物堿后皮層薄壁組織幾乎沒有明顯的熒光差異，而木栓層依舊較亮。見圖3。

4 討論

4.1 延胡索塊莖的組織發育特點 延胡索塊莖的組織結構大體分為木栓層、皮層薄壁組織、形成層以及髓4個部分，并依靠其形成層上隨機產生的具有強烈分生能力的“生長點”，以一年為周期進行新舊交替。野生延胡索“生長點”常為2個，而有資料顯示栽培品種可見2～3個，且都呈對稱分布[6]。可見其產生與營養物質有著密切的聯系，而促進“生長點”產生可使其繁殖率得到提高。與此同時，淀粉作為植物儲存能量的一種方式，也跟隨塊莖的新舊交替產生消長變化。因此，延胡索在夏初地上莖枯萎時采收，此時延胡索已經完成了新舊代替，淀粉粒含量充足，產量質量最佳。

注:A、B、D.不規則的形成層;C.可見生長點;E.向兩邊延伸的形成層;F.疏松的原皮層薄壁細胞,擴大且占主要位置的生長點;向左箭頭指向形成層,向上箭頭指向生長點,向下箭頭指向新形成層,向右箭頭指向原生導管,右上箭頭指向原皮層薄壁細胞;標尺示200 μm圖2 一年生延胡索石蠟切片(4×10倍)

4.2 生物堿的積累規律 生物堿是一種在植物的生長發育過程中起到重要作用的次生代謝產物，存在于100多個科的植物中[7]。延胡索中生物堿成分在紫外光下受到激發后會呈現黃綠色熒光，并且熒光強度與含量成正比[8]，因此能在熒光顯微鏡下直觀地看到生物堿在其塊莖中的分布特點。

有研究顯示，植物次生代謝產物總是分布在易受侵害的組織中，而本實驗結果顯示，在不同生長時期延胡索中幾乎各個組織部位均含有生物堿，其中靠近木栓層內部的生物堿含量較高。木栓層是進行次生生長的植物的重要保護組織，因此二者是相符合的。但由于延胡索中含有大量淀粉粒以及具有強烈熒光反應的木質素可能會對熒光反應的結果產生干擾，且酸對木質素沒有影響[9]，因此，本研究觀察單純淀粉粒的熒光反應以及利用酸性醇溶液對生物堿進行抽提后的塊莖切片，結果顯示單純的淀粉粒在熒光顯微鏡下并沒有顯示熒光，這可能與其熒光強度太弱有關；而提取生物堿后，靠近木栓層內側的熒光差異消失。由此可見，生物堿在塊莖中的分布是具有差異的，且這種差異并不隨時間的變化而產生不同部位的定向聚集性。

注:A.木栓層內側明顯較亮(多年生塊莖,×10倍);B.外側皮層薄壁組織較亮(多年生塊莖,×5倍);C.纖維化的皮層薄壁組織(多年生塊莖,×5倍);D.新生塊莖熒光顯微(多年生塊莖,×5倍);E.靠近凹陷部分的導管呈黃色(一年生塊莖,×5倍);F.陰性對照(多年生塊莖,×5倍);向左箭頭指向木栓層,向下箭頭指向外皮層,向上箭頭指向纖維皮層;A中標尺為100 μm,其余圖片中標尺皆為200 μm圖3 新鮮延胡索塊莖冰凍切片

在皮層薄壁組織發生松軟破裂時，其仍具有較高的生物堿含量，由此推測這些化學物質可能具有一定的防御作用，而一年生塊莖凹陷處的木栓化細胞呈現顏色不同的黃色熒光，提示此處的生物堿成分可能不同。另外，許多研究顯示生物堿在植物中的積累還受到環境及生物因子的影響，如無機物的供給、溫度、海拔、真菌的攻擊[10]，因此對于延胡索塊莖中生物堿分布的影響因素還可進一步深入研究。

4.3 生物堿分布與淀粉粒的關系 皮層薄壁組織熒光強度隨著淀粉粒的增加而增加，而沒有淀粉粒的形成層部位則幾乎沒有熒光，推測其生物堿含量可能與淀粉粒有關。有相關文獻顯示，貝母栽培品種的生物堿含量與淀粉粒的積累無規律的相關，而野生品種則與淀粉含量呈正相關[11]。究竟此類以地下莖入藥的植物生物堿含量與淀粉粒的產生有何聯系，還需要進一步的研究。