薔薇科果實類藥材脂肪酸不同樣品前處理的GC-MS分析

楊 沫，況作品，方文韜，謝曉梅

(1.安徽中醫藥大學科研實驗中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學藥學院 現代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

中藥中的有機酸是發揮臨床療效的重要活性成分[1-2]，主要包括脂肪酸、酚酸和萜酸等。文獻調研發現，酚酸和萜酸類的分析檢測采用常規的反相高效液相色譜法[3-6]，而脂肪酸則更適合采用氣相色譜法，特別是氣相色譜-質譜聯用法(gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS)[7-8]。采用氣相色譜法檢測分析中藥中脂肪酸時，由于受到實驗溫度下脂肪酸難以氣化的局限，所以一般需要對脂肪酸進行衍生化處理。中藥樣品中脂肪酸衍生化應用較為廣泛的是甲酯化法，主要有酸處理法、堿處理法、三氟化硼法等，優缺點各異[9-12]。在文獻報道的甲酯化處理法中，有將樣品粉碎后直接加入甲酯化試劑進行衍生化[13-14]；也有先提取樣品中脂肪酸成分，再加甲酯化試劑至提取物中進行甲酯化[15-16]。不同樣品狀態下的甲酯化對中藥脂肪酸分析有何影響鮮見報道。本研究考察了2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)收載的5種薔薇科果實類“味酸”藥材(木瓜、烏梅、山楂、覆盆子和金櫻子)，采用直接甲酯化和不同濃度乙醇提取后再甲酯化的供試品溶液制備方式，利用GC-MS同時測定多種脂肪酸，旨在為GC-MS測定中藥脂肪酸的樣品前處理選擇提供科學依據，同時也為5種藥材的脂肪酸表征和比較提供實驗資料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 7890B/5977A氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；BP211D電子天平：德國賽多利斯公司；KQ-250DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q Advantage超純水機：美國Millipore公司；氦氣(載氣，純度>99.999%)。

1.2 試藥 所測藥材樣品均購自安徽省亳州藥材市場，經安徽中醫藥大學周建理教授鑒定基原為薔薇科植物果實木瓜[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai]、烏梅[Prunusmume(Sieb.) Sieb. et Zucc.]、山楂(CrataeguspinnatifidaBge. var. major N. E. Br.)、覆盆子(RubuschinginHu)和金櫻子(RosalaevigataMichx.)。藥材經60 ℃干燥后粉粹(過40 目篩)備用。所用試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 儀器條件 參考文獻[16]并通過條件優化建立本方法。色譜條件：HP-5MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；氣化室溫度280 ℃；柱溫：程序升溫，初始溫度40 ℃，保持3 min，40 ℃升至192 ℃(每分鐘4 ℃)，保持7 min，192 ℃升至280 ℃(每分鐘4 ℃)，保持5 min；分流進樣，分流比10∶1；進樣量1 μL；載氣：氦氣；流速：1 mL/min。質譜條件：EI源，電離能量70 eV，溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；發射電流100 mA；檢測電壓1.1 kV；檢測增益11.2；傳輸線溫度280 ℃；掃描質量范圍：40～450 amu。溶劑延遲時間為2.9 min。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 直接甲酯化 參照文獻[17]并作優化調整。取供試品粉末1.0 g，精密稱定；置50 mL試管中，加入H2SO4-CH3OH(1∶10)溶液20 mL，密閉，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，60 ℃恒溫水浴24 h；冷卻至室溫，上清液定量轉移至盛有20 mL水的分液漏斗中，再精密加入20 mL CH2Cl2，充分振蕩后靜置2 h，收集CH2Cl2層，經飽和NaCl溶液洗滌后加5 g無水Na2SO4脫水，濾液即為供試品甲酯化溶液Ⅰ。

2.2.2 提取后甲酯化 參照文獻[15]并作優化調整。取供試品粉末2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入90%、50%乙醇溶液各40 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，濾過，濾液蒸干；殘渣加水20 mL，用1 mol/L NaOH溶液調pH至11.0，加入等容積石油醚并充分振蕩；取水層，用1 mol/L HCl溶液調pH至2.0，分別加入等容積乙酸乙酯、正丁醇萃取，有機相減壓回收溶劑；加H2SO4-CH3OH(1∶10)溶液20 mL置殘渣中，按“2.2.1”項下方法得供試品甲酯化溶液Ⅱ、Ⅲ。

2.3 供試品溶液的測定 取“2.2”項下制備的5種供試品各甲酯化溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，按“2.1”項下條件進樣分析，得各藥材3種甲酯化溶液GC-MS總離子流圖(見圖1)。采用NIST11數據庫對各甲酯化溶液Ⅰ的總離子流圖進行譜庫檢索，依據相似度匹配并參考文獻，對相對面積大于0.1%的峰進行成分辨識；利用面積歸一化法計算各峰相對含量。5種藥材主要脂肪酸成分測定結果見表1。

3 討論

HP-5MS彈性石英毛細管采用非極性的(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷固定相，組分按照沸點高低依序出峰，一般小分子沸點低，保留時間短，分子量增大保留時間延長。通過對薔薇科5種果實類藥材粉末直接甲酯化和經提取后提取物甲酯化的不同樣品前處理方式比較，發現檢測結果顯示出較大的差異。由圖1(AⅠ—EⅠ)可見，直接甲酯化可檢測出種類更多的脂肪酸，包括短鏈和長鏈脂肪酸(C2—C24)。而提取后甲酯化的檢測結果與提取溶劑的極性大小有關，極性大有利于表征短鏈脂肪酸，如50%乙醇提取利于蘋果酸、檸檬酸等小分子多元酸(圖1中AⅢ—EⅢ)檢測；極性小有利于表征長鏈脂肪酸，如90%乙醇提取利于油酸、亞油酸等高級脂肪酸(圖1中AⅡ—EⅡ)的檢測；5種藥材基本呈現同樣現象，顯示供試品制備方式對甲酯化檢測脂肪酸影響的規律性。鑒于溶劑極性對檢測結果的影響，實驗中對提取物衍生化反應產物的提取也分別選擇了正丁醇和乙酸乙酯兩種不同極性的溶劑。為了便于顯示不同甲酯化方式對脂肪酸檢測的影響，本研究對總離子流圖縱坐標示值作了歸一化處理。

注：Ⅰ.直接甲酯化；Ⅱ. 90%乙醇提取后甲酯化；Ⅲ. 50 %乙醇提取后甲酯化

圖1木瓜(A)、烏梅(B)、山楂(C)、覆盆子(D)和金櫻子(E)3種甲酯化方式的GC-MS總離子流圖

對能反映較多脂肪酸信息的直接甲酯化方式檢測圖進行成分和相對含量分析，表1可見 5種藥材含脂肪酸種類和含量存在明顯差異，在種類上從大至小的順序為木瓜(相對含量大于0.10%有27種)、山楂(相對含量大于0.12%有19種)、金櫻子(相對含量大于0.13%有16種)、烏梅(相對含量大于0.20%有12種)、覆盆子(相對含量大于0.16%有12種)；5種薔薇科果實類藥材共有成分為蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等短鏈多元脂肪酸以及油酸、亞油酸和硬脂酸等高級脂肪酸；對于水溶性短鏈脂肪酸檢測結果與課題組前期HPLC分析結果趨勢基本相同，木瓜、烏梅和山楂富含蘋果酸或檸檬酸，而覆盆子和金櫻子各有機酸含量均較低[18]。值得一提的是本方法未能檢測到在5種藥材中較多存在的脂環族水溶性有機酸——莽草酸和奎寧酸。

實驗中發現脂肪酸成分的檢測結果除了與衍生化方法、衍生化條件參數以及本實驗考察的在相同衍生化方法中樣品不同物理狀態有關外，還與分析參數有關，如色譜柱程序升溫中初始溫度和升溫速度的設定以及質譜的掃描質量范圍；特別是初始溫度設定較高時不利于檢測到短鏈脂肪酸，如蘋果酸；程序升溫速度較快時不利于性質相似組分的分離，如亞油酸和油酸。

表1 薔薇科5種果實類藥材主要脂肪酸成分相對含量測定結果

綜上，在相同的氣相色譜分離檢測條件下，不同樣品前處理方法對脂肪酸的檢測結果存在明顯差異。采用超聲波輔助H2SO4-CH3OH溶液一步提取衍生化(藥材粉末直接甲酯化)可較全面地同時了解短鏈和長鏈脂肪酸成分的種類信息，是GC-MS測定中草藥脂肪酸方便快捷的甲酯化方法。