基于HRM技術的小麥光周期基因功能標記的開發和應用

李立群，程 顯，殷 楠，鄭錦娟，任慧麗，南春芹，楊智全

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌712100)

小麥光周期反應特性及春化作用直接影響小麥品種的利用、種植區劃、引種及栽培技術，間接影響產量、抗病、抗逆等許多重要的農藝性狀［1］。挖掘小麥光周期基因及其春化特性，對于利用分子育種選育小麥新品種具有重大意義。

筆者所在課題組通過同源克隆得到與小麥春化作用和光周期密切相關的小麥光周期基因TaCO9－1A，該基因冬性品種較春性品種的第二外顯子在321 bp處有6個堿基的缺失，關聯分析表明，該等位變異與抽穗期及開花期顯著關聯，是一個與冬春性相關的基因［2］。

高分辨率熔解曲線分析技術(high resolution melting curve，簡稱HRM)是一種基于堿基熔解溫度差異所形成的不同熔解曲線的基因分析新技術。該分析技術因具有通量高、成本低、結果準確、不受檢測位點限制等優點得到普遍關注［3－5］。尤其對于多樣本基因分型、突變掃描、甲基化分析、序列匹配等檢測優勢顯著［6－8］。目前，在醫學疾病診斷、蔬菜、果樹等作物種質資源和新品種鑒定方面應用較廣［9－11］，但在小麥中的應用研究才剛剛起步。

本研究依據TaCO9－1A基因在冬春性品種中的序列差異，開發標記，利用高分辨率熔解曲線分析技術對223份小麥品種及冬春品種雜交的F2代群體進行基因分型，并采用傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行分型驗證。田間表型及基因型相關分析表明，該標記及高通量分子檢測方法可以快速、簡單地區分小麥的冬春性。本研究對于分子標記輔助選擇育種、品種冬春性檢測及品種區劃等具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用材料為典型的強冬性小麥品種中麥895和春性小麥品種寧春4號以及其他來自不同麥區的223份自然群體。2個分離群體，即春性品種揚麥14與冬性品種中麥895雜交后代103株F2代及其對應的F3代株系(群體Ⅰ);揚麥14和冬性品種陜農56雜交后代297株F2代及其對應的F3代株系(群體Ⅱ)。

2個雜交組合的F2代于2014年10月種植在西北農林科技大學斗口綜合試驗站，對標記的植株單株收獲，脫粒。F3代于2015年10月種植在楊凌榮華種業有限公司試驗田，2行種植，行長1 m，行距25 cm，自然群體于2014年及2015年10月種植在西北農林科技大學北校試驗田，按常規田間管理。

試驗所用的主要儀器包括羅氏熒光定量PCR儀LightCycler96、北京君意JY－5000電泳儀及JY－CX3B電泳槽、Bio－Rad C1000基因擴增儀等。

1.2 方法

1.2.1 小麥DNA的提取 2014年11月對自然群體葉片進行取材以提取基因組DNA;對標記的F2代群體材料葉片進行取樣，并提取葉片基因組DNA，每份材料取0.2～0.3 g新鮮葉片，用液氮預冷后粉碎并放入1.5 mL離心管中，按照十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)方法提取小麥基因組DNA。

1.2.2 引物設計 根據美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)網站中公布的TaCO9基因序列(Gene登錄號:236233)參照設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，純化方式為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。試驗所用的 TWS［T代表小麥(Triticum aestivum L.)，W代表冬性(winter)，S代表春性(spring)］標記擴增引物，上游引物F:5'－GGAAGAGGCGGCGGTA CGAG－3';下游引物 R:5'－GAGCGGAACCACCCGAGGTC －3'。

1.2.3 HRM分析技術反應體系及程序 PCR和HRM分析過程均在羅氏LightCycler@96上進行，反應條件見表1。HRM的反應體系為 20μL:80 ng模板 DNA，上下游引物各0.4 μmol/L，10 μL LightCycler HRM Master Mix(Roche)，1.5 mol/L Mg2+(Roche)，其余用ddH2O補足。HRM分析反應程序中首先是普通PCR反應程序，得到PCR產物后進行HRM分析。

表1 HRM分析技術反應條件

1.2.4 HRM擴增產物的序列分析 本研究采用品種中麥895和寧春4號的HRM反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，將目標片段切膠回收，用pMD18－T載體進行克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。每個品種至少測定10個克隆，以確保核苷酸序列的準確性。引物的擴增產物序列等位變異采用DNAMAN軟件進行分析，并在NCBI數據庫上進行比對。

1.2.5 小麥TaCO9－1A基因功能標記檢測群體的多態性利用TWS引物對樣品進行PCR擴增，PCR反應采用25μL體系:10×PCR 緩沖液(含 Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.125 μL，用ddH2O 補至25μL。擴增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，32個循環;72℃ 10 min。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，記錄帶型。

1.2.6 田間性狀調查及其關聯分析 對田間種植材料的抽穗期和開花期進行調查，記錄日期。小區60%以上的穗部露出2/3記為抽穗，小區60%以上的穗中部小穗開花記為開花。其中F2∶3群體抽穗期和開花期以平均值替代。用Excel 2007對田間表型數據進行初步處理，然后使用SPSS軟件對不同基因型所對應表型平均值進行t檢驗和Duncan's檢驗(由于表型數據為日期且多為4月份，因此以4月1日為參考標準，將其換算成具體時間，例如4月16日等同于16 d，5月3號等同于33 d)。

2 結果與分析

2.1 HRM技術分析中麥895和寧春4號的基因型

用特異TWS標記引物對材料中麥895和寧春4號進行HRM分析，結果顯示，這2個材料的高分辨率熔解曲線差異明顯(圖1)，這是由于中麥895的擴增產物有6 bp堿基的缺失，而寧春4號有6 bp堿基的插入，因此產生了2種截然不同的熔解曲線，將寧春4號命名為春性小麥(TS)基因型材料，將中麥895命名為冬性小麥(TW)基因型材料。

2.2 擴增產物的序列分析

通過比對TWS引物擴增產物測序結果，發現寧春4號的擴增產物序列比中麥895的序列多6個堿基的插入(圖2)。說明HRM分析的熔解曲線的差異是由TaCO9－1A基因6 bp堿基的插入/缺失引起的。

2.3 HRM技術對自然群體的基因分型

將中麥895與寧春4號作為對照，利用HRM技術分析自然群體材料的TS基因型與TW基因型，高分辨率熔解曲線與寧春4號相近的材料為TS基因型，與中麥895相近的材料為TW基因型。結果顯示，在223份材料中有99份材料的熔解曲線與寧春4號的熔解曲線相近，124份材料的熔解曲線與中麥895的熔解曲線相近(具體材料未列表)，由此得出供試材料中TS基因型材料有99份，TW基因型材料有124份(圖3)，表明HRM分析技術能夠用于基因堿基缺失/插入等位變異的高通量分子檢測。

2.4 自然群體中TaCO9－1A基因型多態性檢測

利用特異TWS標記對223份供試小麥品種TaCO9－1A基因多態性進行檢測，聚丙烯酰氨凝膠電泳結果顯示，99份小麥帶型與寧春4號的TS型一致，124份小麥帶型與中麥895的TW型一致(圖4)。該檢測結果與HRM基因分型結果完全相同，說明HRM技術可以實現高通量分子檢測。

2.5 F2代群體的TaCO9－1A基因型分析

利用HRM分析技術對揚麥14/中麥895、揚麥14/陜農56 2個組合的F2代群體進行檢測，得到與圖3相似的基因分型圖。再利用傳統的PAGE技術進行TaCO9－1A的遺傳多態性分析，PAGE結果顯示3種帶型:1種199 bp的條帶(TS型)、1種193 bp的條帶(TW型)和既有199 bp也有193 bp的條帶(TS/W型)。103株群體Ⅰ中，22株為TS型，50株為TS/W型，31株為TW型;297株群體Ⅱ中，60株為TS型，157株為TS/W型，80株為TW型(圖5)，分型結果與HRM分型結果完全一致。且F2代基因型TS型 ∶TS/W型 ∶TW型=1∶2∶1的分離比例，表明利用該標記的2種方法都可以在育種的分離群體中進行基因分型。

2.6 自然群體基因型與田間表型的相關性

根據苗期、抽穗期和開花期的生長發育情況綜合判斷小麥品種冬春性。由表2可知，供試材料的抽穗期、開花期在2015年及2016年整體差別不大。具有TS型TaCO9－1A基因的小麥品種抽穗期或開花期較早［(14±2.14)d～(23±1.86)d］，而具有TW型TaCO9－1A基因的小麥品種抽穗期或開花期較晚［(22±2.47)d～(29±2.80)d］，且 TS型品種的平均抽穗期、開花期分別比TW型品種提早8、6 d，該標記與抽穗期及開花期顯著關聯(p＜0.01)。

表2 部分小麥品種在不同年份的抽穗期和開花期

2.7 F2代群體的基因型與F2∶3群體田間表型的相關性

對2個F2∶3群體的小麥材料抽穗期和開花期進行統計，用SPSS軟件分別對2個群體不同基因型的表型數據進行統計分析，結果顯示，2個群體中均檢測到各基因型間抽穗期和開花期的差異達到了極顯著水平。可見TaCO9－1A基因中6 bp堿基的插入/缺失突變會使小麥春冬性相關性狀的日期顯著提前。由TWS標記判定的冬春性小麥品種與田間表現及資料記載的基本一致，說明利用該分子標記檢測的小麥的冬春性具有較高的準確性。

3 討論

HRM分析是一種高度靈敏、快速掃描PCR擴增產物內單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)變異的簡單有效的方法［12］，該技術已經成功應用于同源四倍體植物苜蓿和馬鈴薯的SNP基因分型和多態性檢測［13－14］。筆者所在課題組前期利用HRM技術進行TaGW2－6A基因“T”插入突變的分子檢測，準確區分籽粒大小基因型，并通過常規的Sanger測序驗證了該方法的可靠性［15－16］。本研究利用HRM分析技術將小麥材料的冬春性明確分型。可見，HRM是一種準確而高效的SNP檢測和基因分型技術，解決了小麥基因位點單堿基突變和小片段插入/缺失高通量檢測的難題，為小麥分子標記輔助選擇育種奠定了技術基礎。

本研究同時利用HRM分析和特異的SSR標記的PAGE對223份不同小麥品種及2個雜交組合F2代群體進行了TaCO9－1A基因分型，分型結果一致，TS型材料99份，TW型材料124份。相比而言，HRM操作簡單，靈敏快速、結果直觀，是一種高通量的檢測方法。

目前已報道的小麥春化基因主要有Vrn－A1、Vrn－B1和Vrn－D1，且對冬春性作用大小依次為Vrn－A1＞Vrn－B1＞Vrn－D1［17］，可根據這3種基因的不同顯隱性組成來預測小麥品種的冬春性［18－19］。但也有其他調控因子參與影響小麥的冬春性［20］。本研究結果表明，小麥光周期基因TaCO9－1A明顯影響小麥品種的抽穗期和開花期，針對該基因開發的標記可用于小麥品種的冬春性鑒定。本研究開發的高分辨率熔解曲線分析方法為高通量分子檢測及標記輔助選擇育種奠定了技術基礎。