馬鈴薯野生種Solanum pinnatisectmumgn與栽培種下寨65原生質體融合與培養研究

孫海宏，王 芳，葉廣繼

(1.青海大學農林科學院，青海西寧810016;2.青藏高原生物技術教育部重點實驗室，青海西寧810016)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是茄科茄屬的一年生草本植物，糧菜兼用，在世界上種植范圍廣，抗旱，耐瘠薄，是繼水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。其抗病、抗寒、抗旱、早熟性、豐產性等優良性狀的選育一直備受關注。馬鈴薯現有的栽培種遺傳背景狹窄，親緣關系近，后代變異僅停留在近交水平，所以常規育種很難選育出優良抗性品種［1］。在馬鈴薯的野生種中含有大量的抗病基因和特殊基因，這為馬鈴薯育種提供了豐富的基因庫［2］。然而，生產上應用的普通馬鈴薯基本為四倍體，野生種為二倍體，由于胚乳平衡數(EBN)的差異，很多野生種與栽培種存在雜交障礙，常規育種技術不能滿足現在的育種需要。利用體細胞雜交技術可以克服馬鈴薯栽培種和野生種間由于倍性不同引起的生殖隔離，將野生種的優良基因導入栽培種以改良品種性狀［3］。馬鈴薯原生質體融合培養是利用細胞雜交技術進行育種的基礎。但所用材料的基因型不同，會導致原生質體融合和培養的結果存在差異。影響原生質體融合培養的因素主要包含基因型、培養條件，培養基組成等［4－5］，馬鈴薯野生種 Solanum pinnatisectmum有豐富的抗性基因，包括高抗晚疫病(PVX、PVY、PLRV)和抗病毒病等，栽培種下寨65是青海省主栽品種，但該品種極易感染晚疫病。本試驗通過對影響原生質體融合、培養的相關因素進行研究，旨在獲得一種穩定的適合于馬鈴薯野生種Solanum pinnatisectmum與栽培種下寨65試管苗葉片的原生質體分離融合培養體系，為馬鈴薯野生種及與栽培種之間的體細胞雜交奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 融合親本原生質體的分離純化與活力檢測

選用青海省農林科學院青藏高原生物技術教育部重點實驗室保存的馬鈴薯野生種Solanum pinnatisectmum和下寨65無菌苗，通過單節切段擴繁于不含任何激素的MS培養基中繼代培養;取培養21 d左右的試管苗上部充分展開的3～4張葉片，于超凈工作臺中切成3 cm左右寬的細長條帶放入10 mL酶解液中。酶解液成分:纖維素酶(OnozukaR－10)、果膠酶(Y－23)、離析酶(OnozukaR－10)、3 mmol/L MES［2－(N －嗎啉)乙磺酸］、2%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0.2%BSA、0.35 mol/L甘露醇。將含有葉片的酶解液置于25℃、40 r/min的恒溫搖床中黑暗解離12～14 h(本研究所用培養基均參照周宇波等的基礎配方［6］，不再列出)。

酶解液用100目的尼龍膜過濾到10 mL離心管中，于600 r/min離心5 min，棄上清液，緩慢加入2 mL MR(含有63.75% 甘露醇)混合均勻后，緩緩加入到有7 mL高濃度蔗糖溶液(含有23%的蔗糖)的10 mL離心管中，600 r/min離心6 min。用微量移液器將液體中環狀原生質體吸出，用MPS再次將其懸浮，600 r/min離心5 min，重復2次，得到的沉淀物即為純化的原生質體。調整S.pinnatisectmum原生質體的終密度為2×105個/mL左右，用于原生質體融合。

原生質體活力檢測:采用熒光素雙醋酸酷(FDA)法檢測原生質體活力，FDA先用丙酮制備成0.5%的貯備液，0℃保存?；盍z測時，取0.5 mL純化好的原生質體，加入10μL FDA使FDA終濃度為0.01%，混勻后置于室溫下5 min。在熒光顯微鏡下觀察，激發濾光片為QB24，壓制濾光片為JBS。由于葉綠素的存在，有活力的葉肉原生質體發黃綠色熒光。每個數據為10個視野的平均數，原生質體活力計算為發黃綠熒光的原生質體數占原生質體總數的百分率。

1.2 原生質體的融合方法研究

1.2.1 化學融合方法 融合誘導液(FA)的組成為8 mmol/L CaCl2+0.7 mmol/L KH2PO4+25% 聚乙二醇(PEG)，pH 值為5.8，過濾滅菌，4℃下保存備用，聚乙二醇為PEG－6000。融合固定液(FB)為80 mmol/L CaCl2，溶液pH值為10，高溫滅菌。

融合方法:將純化好的雙親原生質體懸浮液(密度約為2×106個/mL)按1∶1比例混合，用滴管將原生質體懸浮液均勻地滴于一無菌的培養皿底部，靜置3 min，在懸浮液頂部加入1滴融合誘導液EA，室溫下靜置15 min，然后在其頂部加入1滴融合固定液FB，再靜置10 min，用MPS培養基漂洗2次，調整密度培養。

1.2.2 電融合方法 電融合儀為Eppendorf的Multiporator 4308型融合儀，融合室為250μL螺旋型鉑金電極，間距0.2 mm。

電融合液的組成:0.35 mol/甘露醇 +0.2 mmol/L CaCl2，pH值為5.8，高溫滅菌。

將雙親的原生質體按1∶1比例混合，用加樣槍吸取245μL細胞懸浮液小心地加入到融合池底部，操作過程中避免打濕融合池的邊緣及內側，以免產生氣泡而影響融合效率。將鉑金電極小心地插入融合池中，緩慢旋緊，然后連接到共軸連接頭上，進行融合。基本融合參數為交變電壓80 V/cm，成串時間10 s，直流脈沖1 000 V/cm，作用時間60μs，脈沖1次。

1.3 增殖培養基激素水平的篩選研究

1.3.1 材料 以S.pinnatisectmum和下寨65融合再生的愈傷組織為試驗材料。

1.3.2 方法 將約0.1 mm的增大的細胞團從MPScul培養基中轉入增殖培養基中，增殖培養基在0.4 mg/L細胞分裂素(6－BA)條件下，設置了3個NAA濃度處理(表1)。

表1 愈傷增殖培養基中NAA濃度試驗設計

1.4 芽分化培養基中的激素濃度搭配試驗

1.4.1 材料 以S.pinnatisectmum和下寨65融合再生的愈傷增殖組織為試驗材料。

1.4.2 方法 研究前人關于馬鈴薯愈傷組織芽分化過程中激素使用濃度基礎上，選取直徑大于3 mm的愈傷組織為試驗材料，設置了4種分化培養基(表2)，4個月時統計愈傷組織的最初芽分化時間和分化率(最初芽分化時間指愈傷組織接種到分化培養基上的時間到初次芽分化的天數，分化率為每皿能夠分化的愈傷數占接種總愈傷數的百分率)。

2 結果與分析

2.1 原生質融合方法研究

通過化學融合和電融合2種融合方式的比較，結果表明，2種融合方式的細胞融合率沒有顯著差異，在前期優化融合條件和融合參數的條件下，其最高融合率均在40%以上，但是融合后的原生質體培養反應存在顯著差異(表3)。電融合的細胞培養反應迅速，培養后24 h細胞開始膨大，而PEG融合的細胞需要48～72 h才開始膨大，培養至第10天時統計細胞的植板率，電融合細胞的植板率為33.6%，顯著高于化學融合方式的20.8%。方差分析結果表明，在愈傷組織分化成苗能力上，電融合的細胞也顯著強于化學融合。但是兩者的愈傷組織挑出后轉移至分化培養基上均生長正常，表現在初次分化成苗的時間和雜種植株比例上并沒有顯著差異。由此可見，PEG對細胞的生長存在一定的抑制作用，集中表現在原生質體培養前期。

表2 芽分化培養基中的激素濃度搭配試驗

將含有融合細胞的混懸液滴于3 mm無菌培養皿(培養皿中含有2 mL MPScul培養基，每皿3～4滴)進行黑暗培養，此階段培養時間約為3周。隨著細胞的繼續分裂，可見米白色的“小點”，經過14 d培養，一部分細胞團能長成直徑約1 mm的小愈傷。此時，可以陸陸續續將小愈傷組織挑至愈傷增殖培養基上。

表3 不同的融合方式對原生質體融合及培養效果的影響

2.2 增殖培養基激素水平的篩選研究

愈傷組織接種到不同分化培養基上以后，愈傷組織形態特征表現出差異，只有在B處理(NAA濃度為1 mg/L)上，愈傷組織生長旺盛，進一步增大，顏色由淺綠色逐漸變為鮮綠，而在其他處理的分化培養基上，愈傷組織均生長緩慢，并出現了不同程度的黃化現象(表4)。

表4 愈傷增殖培養基中NAA濃度對愈傷組織生長的影響

2.3 芽分化培養基中的激素濃度搭配試驗

在本試驗條件下，愈傷組織的生長速度適中，愈傷組織的狀態適宜進一步分化培養要求，以NAA的濃度為1.0 mg/L配合0.4 mg/L 6－BA，具體結果見表5所示。結果表明，雖然4種激素濃度搭配處理都可以誘導馬鈴薯愈傷組織分化，但不同處理間的分化時間和分化頻率差異顯著。對于愈傷組織而言，以 B 處理(0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L Zeatin)的誘導分化效果最好，愈傷組織在分化培養基上生長約60 d時開始分化形成小芽，平均的分化頻率達16.7%，顯著好于其他分化處理。

培養過程中還發現，在愈傷組織快速增殖階段，馬鈴薯的愈傷組織培養區別于其他作物，不需要作滲透壓的降壓處理，改變滲透壓反而對愈傷組織生長不利。

在愈傷中分化出3 mm芽時將芽切下，移入普通的MS培養基中進生根培養成完整植株，親本融合率及倍性分析由流式細胞儀(Guava EasyCyte 10)進行檢測，形成的六倍體有雙親的染色體組雜種，占總雜種的30%。整個原生質體分離純化及融合培養過程見圖1。

表5 愈傷增殖培養基中不同激素配比對芽分化的影響

3 結論與討論

細胞融合對于有雜交障礙親本是一個非常有用的育種手段，要有目的地選擇親本材料，應該多選擇近緣種進行原生質體融合。但不同基因型之間的融合細胞對培養反應有較大差異，本試驗是眾多親本組合中篩選出來的容易培養的組合，其細胞啟動分裂較快，培養25～30 d時可形成直徑達1 mm的小愈傷組織，繼而可以形成數量龐大的愈傷組織。能夠分化的愈傷組織初次分化時間相差不大，約為60 d左右，但表現出較長的持續分化時間，往往需要4個月的時間，因此，在分化培養基上要定期更換新鮮培養基以保證愈傷組織生長對營養的需求。愈傷組織增殖階段對光照強度異常敏感，置于光照條件下，愈傷組織生長緩慢，結構變得異常致密，少量愈傷出現褐化現象。本研究中，不確定這是2個親本的最佳融合培養體系，但確定是有效的體系。在今后的原生質體融合研究中，將根據育種目標，進行更多的親本組合研究，進一步改良融合培養體系，更有效將此技術用于馬鈴薯的育種工作當中。