二穗短柄草Trihelix轉錄因子家族的基因組學分析

胡風越，劉廷武，周曼麗，周穎君，周 芮，楊立明，紀劍輝

(淮陰師范學院生命科學學院，江蘇淮安223300)

在植物的轉錄因子家族中，研究得較為全面的是與逆境相關的轉錄因子，如 ABF、MYB、NAC、DREB、DOF、WRKY 等轉錄因子家族，對這些轉錄因子相關基因的恰當的轉化運用，可以提高植物對逆境脅迫的耐受性［1－6］。Trihelix轉錄因子是與抗逆相關的轉錄因子家族之一，目前在擬南芥、水稻、棉花、高粱等植物中均有相關研究。研究顯示，擬南芥中有30個Trihelix轉錄因子，而水稻中含有31個［7］。此外，由于Trihelix轉錄因子在光應答反應、植物生長發育和逆境脅迫中顯著的調控作用［8－12］，它們對生產實踐中的品種改良應用具有重要意義。二穗短柄草由于具有植株矮小、生育期短、遺傳轉化率高以及其與小麥基因組相似度高達95%、能同樣感染小麥易感的各種細菌的特點，成為繼擬南芥和水稻之后新型模式植物的理想植株，并能有效彌補模式植物水稻的不足［13－14］。本研究利用生物信息學分析手段，對二穗短柄草Trihelix轉錄因子家族基因進行結構特征、進化情況及染色體定位等分析，并對該基因家族在水稻、二穗短柄草以及玉米等物種染色體區段的復制作了分析，以期更全面地了解禾本科植物Trihelix基因家族。1 材料與方法

1.1 數據的收集與分析

在植物轉錄因子數據庫(Plant Transcription Factor Database，簡稱TFDB)中獲取水稻、二穗短柄草、玉米、高粱及擬南芥中的Trihelix基因序列，隨后對相關數據進行整合分析，利用Pfam方法在水稻中檢測是否存在此家族蛋白的特征結構域，借助同樣的方法，完成對Trihelix特殊結構域的序列篩選，進而得到不同物種Trihelix蛋白的全部序列［15］。利用ExPASy數據庫(http://www.expasy.org/)對二穗短柄草Trihelix蛋白的分子量、染色體位置、等電點等基因組信息進行在線分析［16］。

1.2 保守基序(motif)的鑒定與分析

根據 Trihelix家族保守結構域特點，在 MEME程序(http://meme.nbcr.net/meme/cgi－ bin/meme.cgi)中，將參數設置成“any”，設定這些基序的長度為10～200，預期有20個基序［17］，來分析其蛋白質保守基序。

1.3 Trihelix轉錄因子家族系統進化樹的構建

首先對Trihelix家族特殊保守結構域的氨基酸進行多序列聯配分析，應用Cluster 3.0軟件分析所得結果，隨后借助Mega軟件(http://www.megasoftware.net/)對二穗短柄草Trihelix保守結構域作進一步分析，Bootstrap的值設定成1 000［18］，隨后將 Mega 程序分析的結果借助 WebLogo 3.3 軟件進行圖示化，即可驗證轉錄因子保守域的分析結果。依據二穗短柄草Trihelix特殊結構域分析的方法和步驟，采用鄰接法構建出水稻、擬南芥、玉米、二穗短柄草和高粱中該家族的系統進化樹［19］，發現在不同物種中，Trihelix家族均主要分為5個亞類。這一結果顯示，在植物不同物種中，Trihelix轉錄因子家族基因仍具有較高的保守性。

1.4 Trihelix基因家族的染色體區段復制分析

利用植物基因組復制數據庫(PGDD，網址為 http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)對所選的 Trihelix 基因各自所在染色體區段的線性復制情況［20］進行分析，將所有存在染色體復制關系的數據進行整理，借助基因染色體定位軟件MapInspect完成圖示化;此外，按照上述方法將二穗短柄草與水稻、二穗短柄草與高粱、二穗短柄草與玉米的Trihelix基因利用植物基因組復制數據庫進行線性復制關系分析，相關結果借助Circos軟件進行圖示化［21］，便可直觀地看出所需檢測的染色體之間的同源性關系。

2 結果與分析

2.1 二穗短柄草Trihelix轉錄因子家族的鑒定

在二穗短柄草基因組數據庫中共鑒定出28個Trihelix轉錄因子。對其蛋白質大小、分子量、等電點以及染色體位置等基本信息進行分析，結果顯示其中氨基酸序列最長的有975個，最短的有128個，分子量為 14.01～96.63 ku，等電點為3.976 3～11.578 9。蛋白結構域保守型分析結果顯示，氨基酸殘基色氨酸(Trp，簡稱 W)－2、W －63、半胱氨酸(Cys，簡稱C)－99(2、63、99分別表示在此氨基酸序列上的第2、63、99位)具有極高保守性(圖1)，且短柄草所有Trihelix轉錄蛋白中均包含典型的螺旋－環－螺旋保守結構。

2.2 二穗短柄草Trihelix轉錄因子家族的進化分析

依據Trihelix蛋白保守序列特點，在MEME程序中采用鄰接法構建了二穗短柄草Trihelix基因家族的進化樹(圖2)，結果將二穗短柄草Trihelix基因家族分為5個亞類。在數量分布上，亞家族Ⅳ中含有最少的Trihelix轉錄因子，而亞家族Ⅴ含有的Trihelix轉錄因子最多;在分支結構上，亞家族Ⅰ和Ⅱ的同源關系相對較近，且可看出在亞家族Ⅴ上的Bradi3g45230基因與其他Trihelix基因的親緣關系較遠。此外，對水稻、擬南芥、二穗短柄草和高粱中的Trihelix蛋白進行聚類分析發現，Trihelix家族均分為5個亞類(Ⅰ～Ⅴ)(圖3)，且每個亞類中均有Trihelix轉錄因子分布，由此可清晰地看出各物種中Trihelix轉錄因子之間的同源關系。高粱、玉米的Trihelix基因進化距離較長，分別有近71%、69%的基因在進化樹的末端才分支，因而推測這2個物種Trihelix基因的進化較晚，其次是二穗短柄草和擬南芥，最早的是水稻。

2.3 二穗短柄草Trihelix家族全長蛋白的結構性分析

基于MEME程序的蛋白結構域分析結果顯示，二穗短柄草的28個Trihelix轉錄因子同樣可被分為5個亞家族，與上述進化樹分析結果一致。就同一亞家族內結構特點分析可知:亞家族Ⅰ中都含有保守基序Motif2、Motif1和Motif5，親緣關系更為接近的Bradi3g46210和Bradi5g11070基因表達蛋白的C端都含有Motif16;亞家族Ⅱ中共有的保守基序與亞家族Ⅰ相比不含有Motif5;亞家族Ⅲ中均存在Motif1和Motif8;亞家族Ⅳ的顯著特征是含有1段由Motif3、Motif1和Motif12相鄰構成的保守序列;亞家族Ⅴ中親緣關系較近的Bradi3g00697、Bradi5g17150、Bradi1g77610 和 Bradi3g30457均含有Motif 3，均與Motif19緊密相鄰，且后3種Trihelix轉錄因子的同源性更高。在不同亞家族之間，根據Motif5和Motif2判斷亞家族Ⅰ和亞家族Ⅱ在系統發生上親緣關系更接近。此外，在所有Trihelix轉錄因子中Motif1蛋白序列高度保守(圖4)。

2.4 二穗短柄草Trihelix轉錄因子家族在染色體上的定位

用Mapinspect軟件分析圖示，可見二穗短柄草的28個保守Trihelix基因在5條染色體上均有分布(圖5)，在3號染色體上分布最多，有9個Trihelix基因，而在1號和4號染色體上最少，僅有3個。并且，Trihelix基因在同一染色體上還存在聚集現象。如在3號染色體上9個Trihelix基因聚集在3個區段，分別位于0.27、32、46 Mb附近;而5號染色體上所有Trihelix基因均聚集在11～28 Mb區段，即位于染色體長臂區段。

2.5 二穗短柄草Trihelix轉錄因子在二穗短柄草、高粱、玉米和水稻中的染色體復制分析

由于高粱、水稻和玉米均為單子葉植物，其相互之間親緣較近，所以通過比較二穗短柄草與這三者之間的染色體復制情況，可以分析Trihelix基因在種內和種間的進化軌跡。復制分析結果見圖6，可見二穗短柄草的染色體有5對，首先，其自身同一亞家族的Trihelix基因會形成復制關系，其次，二穗短柄草與高粱(10對染色體)、水稻(12對染色體)和玉米(10對染色體)也形成了線性復制。據此可推測，在物種進化過程中可能發生了染色體加倍、易位，以及基因的復制、重排、缺失和一些同源基因的丟失等進化事件。

3 討論與結論

Trihelix轉錄因子又稱為GT因子家族［22－23］，因其含有3個螺旋環的特殊保守結構而得名，并且其結構與MYB轉錄因子家族極為相似，但因連接helix的結構不同(“環”或“轉角”)而造成功能上的差異，在系統發生上，Trihelix轉錄因子可能來源于1 個 MYB －like基因［24－25］。

Trihelix轉錄因子最初只在植物中發現，后來有研究推測可能在人類和果蠅中也存在，陸婷婷研究表明，Trihelix轉錄因子在動物和植物中有不同的結構，絕大多數植物Trihelix蛋白為單Trihelix功能域蛋白，而動物中單Trihelix功能域占少數，取而代之出現了3個Trihelix功能域蛋白和6個Trihelix功能域蛋白，且多伴有其他功能域如SCAN功能域［由C2H2鋅指蛋白家族成員SRE－ZBP、Ctfin51、AW－1(ZNF174)和Number 18組成］，以輔助調節動物的生長代謝過程［26］。而在功能上，植物中Trihelix轉錄因子主導光應答、植物生長發育中的蛋白表達調控以及與抗干旱、耐鹽、冷害、病害等逆境脅迫應答相關［11，27－28］，動物中 Trihelix蛋白輔助調控生長代謝，具體功能仍待探索。

本研究通過對二穗短柄草Trihelix轉錄因子的生物信息學分析，共鑒定出5個亞家族共28個Trihelix轉錄因子基因，水稻中是5個亞類31個Trihelix轉錄因子基因，二穗短柄草中Trihelix轉錄因子數量雖不及水稻，但從聚類分析結果來比較，仍具有較高的相似性。水稻、高粱和玉米Trihelix多基因進化關系構建結果同時表明，Trihelix在物種間的進化晚于在物種內的進化;此外，依據Trihelix轉錄因子在系統進化樹上的進化距離，推測Trihelix在高粱和玉米中的進化最晚，在二穗短柄草和擬南芥中次之，最早是在水稻中，但此結論需要進一步研究證實。

綜上，通過對單子葉禾本科模式植物二穗短柄草的生物信息學研究，分析其Trihelix轉錄因子家族基因的鑒定、結構特征、進化特點、染色體定位及復制情況，從而對禾本科植物的Trihelix轉錄因子有更全面的了解，為小麥等其他未測序物種的基因功能分析奠定了基礎。