黑暗脅迫下擬南芥葉片衰老突變體的篩選及鑒定

祁 蒙，賈 敏，劉夏燕

(西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100)

植物衰老是一個年齡依賴的在細胞、組織、器官和生物體水平上的程序性死亡過程，是生長發育的最后一個階段［1－2］。葉片衰老作為植物衰老的主要形式，是葉片細胞對年齡信息及一系列內外環境的總體響應。影響葉片衰老的環境因子包括生物因素及非生物因素，生物因素包括病菌入侵或鄰近植物遮蔽等，非生物因素包括干旱、營養限制、黑暗處理、極端溫度及氧化脅迫等［3－4］。而外界因素的影響，會導致衰老的提前發生［5－6］，例如，黑暗是最有效也是最簡便的誘發衰老的信號，使植物產生快速、一致的衰老表型［7］。在衰老過程中，伴隨著葉片形態上的顯著變化如葉色逐漸黃化，細胞內也發生一系列的生理生化反應［8－9］。首先，生長及環境因素等信號分子激活調控衰老相關基因表達的轉錄因子［10－11］，從而啟動相關基因的表達。隨后，細胞內的各組分開始進入有序的降解過程，其中葉綠體的降解最早發生;伴隨著葉綠體的降解就是葉綠素和蛋白質的降解，典型的葉綠體蛋白如核酮糖二磷酸羧化酶及葉綠素結合蛋白(CAB)等都有很大程度的減少;其他組分如膜脂、核酸等也被一定程度的降解，降解后的小分子營養物質被轉移到新生器官或種子中循環利用［12－13］。葉片衰老是植物進化選擇的產物，能夠幫助植物更好地適應環境并保證后代的繁衍［14］，但另一方面，葉片衰老降低了作物產量和生物量的積累，限制了水果、蔬菜以及觀賞植物的壽命，使植物更容易受到病原體侵害［15－16］。因而，對葉片衰老的研究一方面可以更深入地闡明衰老過程的分子機理;另一方面，對提高作物產量及果蔬儲藏具有重要經濟意義。

目前研究衰老機制主要從遺傳篩選和分子手段兩方面入手。遺傳手段包括篩選和鑒定衰老異常突變體。擬南芥作為模式植物，具有全基因組已經測序、生長周期短、葉片生長發育階段易于區分等特點，成為研究葉片衰老的最適材料［1，4］。擬南芥突變體的獲得主要有物理誘變、化學誘變、T－DNA插入誘變等［17］。化學誘變法作為經典的誘變方法，其產生的突變體為基因功能研究提供了豐富資源。甲基磺酸乙酯(EMS)是一種較為常用的化學誘變劑，能誘發植物產生高密度的系列等位基因點突變，并且誘變頻率高、副作用(致死或不育等)較小、操作簡單［18］，因而被廣泛用于擬南芥的誘變處理。對經過誘變處理后的植物，通常多利用植物表型鑒定、生理生化、遺傳學等方法進行篩選。

本研究先對野生型擬南芥進行時間梯度的黑暗脅迫誘導，獲得一個合理的誘導衰老體系:將擬南芥種子在添加1%蔗糖的MS培養基上持續光照生長7 d，之后移栽至不添加外源糖的MS培養基上，并進行梯度黑暗脅迫處理，植物葉片隨處理時間延長呈現出明顯的衰老表型;接著，將自噬基因突變體在碳素缺乏條件下，經過黑暗誘導后呈現的早衰表型來確定試驗體系的可行性和有效性;最后，以EMS誘變獲得的M2代分離群體為研究對象，進行上述黑暗脅迫體系的誘導，從而篩選出可能的葉片衰老提前或者衰老延緩的突變體，成功獲得了1個衰老提前的突變體asd1－1，進一步對該衰老異常突變體進行了鑒定和研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥(Arabidopsis thaliana)野生型為Columbia(Col－0)生態型。植物經典自噬基因突變體atg5－1、atg7－3由筆者所在實驗室購于擬南芥資源中心(Arabidopsis biological resource center，ABRC)。 突 變 體asd1－1為野生型擬南芥通過EMS誘變篩選得到。

1.1.2 主要試劑 擬南芥培養基質購自Pindstrup Substrate Peat Moss;蔗糖和 EMS購自美國 Amresco公司，瓊脂(BACTO)購自美國BD公司。

1.1.3 溶液 種子漂洗液(50%市售 84消毒液，0.1%Triton X－100);MS全素固體培養基［5 mmol/L硝酸鉀，2 mmol/L硫酸鎂，2.5 mmol/L磷酸二氫鉀，2 mmol/L硝酸鈣，0.05 mmol/L Fe － EDTA，0.1% 微量元素混合液(V/V)，0.02%EMS，1%蔗糖，1%瓊脂;KOH 調 pH 值為 5.8，121 ℃高壓滅菌20 min］。

1.2 方法

1.2.1 EMS誘變 以擬南芥野生型(Col)為材料，利用甲基磺酸乙酯(EMS)化學誘變技術，構建誘變群體，參照Wilson等的方法［19］略作改動。稱取0.4 g(約2萬粒)的野生型種子，于50 mL離心管中用雙蒸水浸泡6～8 h使種子預吸脹。之后吸出水，加入用磷酸緩沖液配制的0.4%的EMS(V/V)，浸泡14 h過夜。處理后的種子，吸出EMS，用蒸餾水反復沖洗數次，每次5 min，即為M1種子。將M1種子種植于培養基質上，混合收獲種子并分組，共得到30個M2誘變群體。將獲得的M2代群體作為篩選對象，通過缺失碳源及黑暗脅迫體系處理，觀察植物表型，篩選可能的葉片衰老相關突變體。

1.2.2 種子表面消毒 每次用千分之一天平稱取0.05 g(約3 000粒)種子，分裝于1.5 mL的離心管中，加入1 mL新配置的種子漂洗液，顛倒數次后，于超凈臺中將漂洗液吸去，用已滅菌的雙蒸水反復洗數遍至不再有漂洗液殘留，最后將種子重新懸浮于無菌水中，置于4℃低溫黑暗處理2～3 d。

1.2.3 MS固體培養基培養 配制含有1%蔗糖的MS培養基并于121℃高壓滅菌。將滅菌后的培養基以每個培養板約40 mL的量均勻平鋪于12 cm×12 cm的方形培養板上，待培養基凝結以備用。用巴氏滴管吸取種子，單粒均勻點播在含有1%蔗糖的MS固體培養基表面。待培養基表面無多余水分后，用封口膜密封培養板。將培養板放入培養間，放置在溫度22℃和光強約100μmol/(m2·s)的持續光照下豎直培養。

1.2.4 黑暗脅迫體系誘導葉片衰老及衰老異常突變體的篩選 將在含有1%蔗糖的MS培養基上光下生長的擬南芥植株，移到不添加外源糖的MS培養基上并完全黑暗處理的體系稱為黑暗脅迫。在含1%蔗糖的MS培養基上生長7 d的M2代植物，于超凈臺中用鑷子小心挑起并移到不添加蔗糖的MS培養基上，封口膜密封后，用錫紙包裹培養板使植物完全黑暗并豎直放入培養箱中培養。在黑暗脅迫處理7 d后，取出黑暗處理過的M2代植株觀察拍照。葉片衰老相關突變體的篩選模式如圖1所示，此時的M2群體中葉片衰老程度不一。將黑暗脅迫7 d的野生型(WT)植株(圖1－A)中子葉明顯黃化、衰老加劇或子葉較綠、衰老延緩的植物挑出(圖1－B)，移栽到植物基質泥炭土中，放入光照培養間正常培養，單株編號并記錄植株表型后收種子。以野生型擬南芥作對照，將第1輪篩選得到的葉片衰老表型異常植株經過黑暗脅迫處理再次驗證葉片衰老表型，能夠維持第1輪得到的葉片衰老加劇或延緩的植物即為可能的衰老異常突變體。具體篩選過程如圖1－C所示。

1.2.5 突變體的衰老表型分析 觀察突變體幼苗的發育狀況、葉色的差異、植株整體表型及在黑暗脅迫處理中植物的衰老情況并拍照。

1.2.6 T－DNA插入突變體的鑒定 進行突變體T－DNA插入鑒定的引物如表1所示。T－DNA插入的純合體植株基因組DNA用自身基因R引物或F引物與T－DNA序列上的LB引物可以擴增出特異條帶，而自身F+R不能擴增出目的條帶。野生型或無插入的植株只有F+R可以擴增出目的條帶。進一步對突變體的T－DNA插入位置進行確定，以純合突變體植株的基因組DNA為模板，用T－DNA序列的左端引物LB與基因組F或R引物擴增，將所得的擴增產物回收后測序并比對分析T－DNA插入位置。

1.2.7 葉綠素的提取及含量測定 取新鮮植物葉片(約20 mg)置于標記好的1.5 mL離心管中，精確稱質量并記錄組織鮮質量后迅速投入液氮中凍存。將植物組織充分研磨至粉末狀，加入1 mL的95%乙醇;避光放入4℃環境中顛倒混勻孵育，孵育時間為5～24 h;孵育完成后，使用高速低溫離心機以14 000 r/min在4℃下離心10 min;轉移上清液到新的離心管中，之后對樣本的吸光度進行測定。將分光光度計設定3個波長(664、649、470 nm)，每個樣本重復測3遍后記錄平均吸光度D664nm、D649nm、D470nm。用95%乙醇調零后，即可進行樣本吸光度的測定，若樣本的吸光度高于1，可以按1∶10的比例進行稀釋。通過計算公式可以得到總葉綠素含量及葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉黃素的量。

表1 ATG5及ATG7 T－DNA插入突變體鑒定引物

1.2.8 擬南芥葉片總蛋白提取及SDS－PAGE分離 取擬南芥葉片組織(約50 mg)置于1.5 mL離心管中，用千分之一天平精確稱量后放入液氮中瞬時冷凍。將葉片充分研磨至粉末狀，按1 mg組織加10μL緩沖液的量加入2×蛋白提取緩沖液，顛倒混勻后放入 65℃干浴2 h。2 h后，室溫以14 000 r/min離心10 min，轉移上清液(即為所需的蛋白樣品)到新的離心管中，蛋白樣品可于－80℃保存。等量的蛋白樣品經10%SDS－PAGE分離后，通過考馬斯R－250染色液染膠，充分染色后，加入脫色液室溫脫色至凝膠空白處藍色完全脫去，拍照分析條帶。

2 結果與分析

2.1 黑暗脅迫體系誘導野生型擬南芥葉片衰老

利用黑暗脅迫梯度處理體系，首先構建了以擬南芥野生型為處理對象的植物葉片衰老模式，以此尋找葉片出現顯著衰老表型的時間點，同時鑒定該黑暗處理體系的有效性。將生長于MS培養基上的7 d的野生型擬南芥，轉移到不添加蔗糖的MS培養基上，經過黑暗脅迫(C－)不同天數處理誘導植物衰老;而對照組植株轉移到含有1%蔗糖的MS培養基上，繼續光下生長。黑暗脅迫處理的時間梯度依次為0、0.5、1、2、3、4、5、7、9 d。取出對應時間點的植物觀察表型，與光下對照相比，在黑暗脅迫誘導5 d后植物葉片顏色開始變黃，7 d后葉片黃化加劇，衰老表型明顯(圖2)。在處理9 d后，植物葉片基本完全變黃。通過對野生型誘導衰老，確定了最為明顯的植物葉片衰老表型開始于處理7 d左右，同時也說明了構建的黑暗脅迫體系確實能誘導植物產生快速一致的葉片衰老表型。

2.2 經典自噬基因突變體的T－DNA插入鑒定及黑暗脅迫誘導葉片衰老

Thompson等將在碳源充足的短日照條件下生長的自噬基因突變體atg5－1和atg7－1，轉移到黑暗中生長一段時間后又回到短日照下生長1周，誘導atg5－1和atg7－1產生了生長減慢和衰老加速的表型，從而證明了其構建的碳源缺乏體系的有效性［20］。因此，先通過從ABRC網站上購買，分別獲得了ATG5基因和ATG7基因的T－DNA插入功能缺失突變體atg5－1和atg7－3，再通過設計引物進行PCR鑒定其T－DNA插入位點(圖3)，獲得其T－DNA插入功能缺失純合突變體。

進一步將突變體atg5－1和atg7－3作為處理對象來檢測該黑暗脅迫體系在鑒定自噬異常突變體葉片衰老表型中的有效性，處理時間為7 d，處理方法同上。在黑暗脅迫體系處理7 d后，取出植物觀察表型，可以看到，經過處理的野生型植物葉片已經開始變黃，這與之前結果一致。然而相比于野生型，處理后的自噬基因突變體atg5－1和atg7－3均表現出更為明顯的葉片黃化衰老表型(圖3)，這與已經報道的經典自噬基因突變體在營養脅迫下產生的超敏感表型一致。同時，觀察光下正常生長的對照組植物，發現突變體與野生型植物葉片顏色并無差異，表明在黑暗脅迫后產生的葉片衰老表型并非由植物本身葉色差異造成。通過已知的自噬突變體在黑暗脅迫誘導下產生的衰老加劇表型，說明構建的黑暗脅迫體系確實可以作為篩選或鑒定衰老異常突變體的有效手段。

2.3 衰老異常突變體的篩選與表型鑒定

通過EMS誘變及黑暗脅迫處理體系，在M2代篩到了3個可能的衰老相關突變體。其中篩到1個在黑暗脅迫處理以后植物葉片顏色明顯黃化、衰老加劇的突變體asd1－1，在后續作為研究對象。將野生型和asd1－1突變體經過黑暗脅迫梯度處理體系誘導，培養時間梯度為 0.5、1、2、3、4、5、7、9 d，將到達處理時間點的植物取出觀察衰老表型，本研究展示了0、1、3、5、7、9 d 這 6 個時間點的植物表型圖(圖 4)。從圖中可以看出，隨時間的延長，黑暗脅迫處理以后的植物葉片逐漸變黃衰老。而對比野生型與asd1－1突變體可以發現，asd1－1突變體衰老更快，在處理5 d后，野生型與 asd1－1突變體已呈現出葉色黃化差異，而在處理7 d后，葉色差異更為明顯;到處理9 d后，雖然二者都衰老嚴重，但 asd1－1突變體的葉片已經開始腐爛。而處理0 d的植物葉片顏色并無差異，表明在黑暗脅迫后產生的葉片衰老加劇表型并非由植物本身葉色差異造成，而可能是ASD1基因在調控葉片衰老中的功能引起。

2.4 衰老葉片中的葉綠素含量測定

現已建立的表征衰老的標記有葉綠素含量、光合效率、基因表達以及蛋白水平的變化等。其中測定葉綠素含量是最為方便和簡單的定量葉片衰老的方法［21－22］。通過測量葉片的葉綠素含量，發現光下對照中的野生型與asd1－1突變體的葉綠素含量在同一時間點差異并不明顯;而在黑暗脅迫處理中的2種基因型植物葉綠素含量都隨著處理時間延長呈下降趨勢，但asd1－1突變體葉綠素下降速率要高于野生型(圖5)。

2.5 衰老葉片中蛋白的降解

將野生型擬南芥與asd1－1突變體在梯度黑暗處理0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 d 后，通過提取衰老葉片的總蛋白及SDS－PAGE電泳檢測葉片總蛋白的降解情況(圖6)。觀察考馬斯亮藍染色的蛋白膠，可以看到在黑暗脅迫誘導的衰老葉片中，蛋白積累明顯降低，而對比于野生型，asd1－1突變體中蛋白的降解更為明顯，尤其在處理3 d以后，asd1－1突變體中蛋白積累，特別是葉綠體蛋白Rubisco大亞基(50 ku)的含量明顯下降。這也間接反映了asd1－1突變體在黑暗脅迫誘導下衰老加劇。

3 結論與討論

植物葉片衰老是植物自身發育階段整合外界環境而表現出的一種自然響應的衰退過程。外界環境(如黑暗誘導、營養限制等)可以促使整個葉片趨于同步化的衰老［23］。前人的研究中常將單個葉片避光黑暗或者采用營養限制(如缺氮、缺碳等)來促使植物衰老，將營養缺乏和黑暗結合起來處理植物幼苗的方法則是一種更為有效的新方法。本研究中，在不提供外源蔗糖的情況下，完全黑暗處理阻止植物進行光合作用，從而抑制內源糖類的產生，形成完全的碳素缺乏。而梯度黑暗脅迫處理的目的在于觀測植物表型及細胞內物質變化的動態過程，為后期試驗提供合理的植物處理時間點。這種黑暗脅迫體系不僅可以實現植物在幼苗期形成快速一致的衰老，并且植物培養基成分易于控制，避免了因外在因素導致的衰老差異。在本研究中建立的黑暗脅迫體系，不僅可以作為篩選植物衰老相關突變體的有效手段，對于已有突變體材料進行衰老相關表型的鑒定也是一種快速而簡便的方法。

利用EMS技術構建突變體庫，從中篩選突變體是一種經典的正向遺傳學方法，該方法有可能篩選到從T－DNA插入突變體庫中無法發現的新基因［24］。在本試驗中，通過對野生型擬南芥進行EMS誘變，篩選到1個衰老表型加劇的突變體asd1－1，進一步對該突變體通過黑暗脅迫體系誘導葉片衰老進行表型驗證，同時檢測衰老葉片中葉綠體基質蛋白的降解情況，發現突變體葉片衰老表型和葉綠體蛋白降解都與野生型存在差異，明確了asd1－1為1個葉片衰老相關突變體，這為后續研究ASD1基因在調控葉片衰老中的功能奠定了基礎。