繡球藤葉片轉錄組分析及SSR引物開發

陶仕珍，田 斌，孫正海，張 睿

(1.云南林業職業技術學院，云南昆明650224;2.西南林業大學，云南昆明650224)

轉錄組是指特定生物體在某種狀態下所有基因轉錄產物的總和。目前，以Illumina、454和ABI為代表的第2代測序技術的迅速發展及隨之產生的諸如SOAP－denov等新的分析方法使人們能更全面快速地了解真核生物復雜的轉錄組［1－2］，更為全基因組測序尚未完成(無參考基因組)的生物提供了組學研究的新途徑［3］。

通過轉錄組測序分析能有效挖掘植物不同組織、不同生長發育時期及在不同環境下的基因表達差異［4］。另外，轉錄組測序對新基因的深度發掘、基因家族鑒定、代謝途徑確定等科學問題提供了新的解決途徑［5］。近年來，由于轉錄組測序成本的降低，通過轉錄組數據開發適用于動植物育種、瀕危物種保護、群體遺傳學等領域的分子標記也已獲得了很好的效果［6］。

鐵線蓮屬(Clematis)是毛茛科(Ranunculaceae Jussieu)的一個世界性分布的大屬，共約有350余種［7］。我國是鐵線蓮屬物種多樣性最高的國家之一，約有147種，其中93種為我國特有［8］。這個屬的植物多為大型攀援草本，并且有很多物種如轉子蓮(C.patens)、毛茛鐵線蓮(C.ranunculoides)、長瓣鐵線蓮(C.macropetala)等花大而艷麗，具有很高的園藝價值。此外這個屬的部分植物如繡球藤(C.montana)、威靈仙(C.chinensis)、小木通(C.armandii)等還有很高的藥用價值。本研究所涉及的物種繡球藤是鐵線蓮屬繡球藤組分布較廣泛的一個物種，自然分布于我國西南以及喜馬拉雅地區，具有良好的藥用價值和觀賞價值［9］。

本研究擬利用Illumina測序平臺對繡球藤葉片的轉錄組進行測序，對其測序組裝得到的unigene進行分類統計、功能注釋以及代謝通路分析，并得到一批簡單重復序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)位點，為今后對鐵線蓮屬植物資源的深入研究和有效利用奠定基礎。

1 研究方法

1.1 總RNA的提取和測序

用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)法［10］提取采自云南省昆明市的繡球藤新鮮葉片的總RNA。RNA的質量和濃度用瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop 2000進行檢測和測定。隨后，分別采用OligodT磁珠試劑盒從質量、濃度合格的總RNA中分離純化出mRNA。加入緩沖液將純化的mRNA打斷成短片段，并以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成單鏈cDNA。合成單鏈cDNA后，加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA，并利用AMPure XP beads純化。純化的雙鏈cDNA經過末端修復、加多聚腺嘌呤尾(ploy A)，連接測序接頭，選擇片段大小以及PCR富集后成為最終的cDNA文庫。最后將獲得的cDNA文庫采用高通量測序平臺Illumina HiSeqTM2500進行轉錄組測序。

1.2 無參拼接及聚類

獲得轉錄組原始測序數據后，采用自行開發的perl編程腳本對原始測序數據進行質量控制和數據過濾。質量控制及數據過濾過程包括4個步驟:(1)去除包含測序接頭的序列;(2)去除N(N表示無法確定的堿基信息)的比例大于10%的序列;(3)去除低質量序列(質量值小于10的堿基數占整個序列的50%以上的序列，其中質量值按照公式Q=－10lg e計算，式中:Q為質量值;e為測序錯誤率(不正確的堿基識別率);(4)去除冗余序列。數據過濾后，將所有過濾序列混合在一起，采用Trinity軟件［2］進行拼接。該軟件拼接過程包括3個步驟:蟲、蛹和蝴蝶，經過這3個拼接步驟后，得到包含大量簡并轉錄本和可變剪接形式的完整序列信息。最后，用CD －HIT軟件［3］(http://www.bioinformatics.org/cd －hit/)對拼接后的序列進行聚類以及冗余序列的去除，聚類后得到的轉錄本為unigene。

1.3 同源搜索及功能注釋

采用NCBI的本地Blast對聚類后得到的轉錄本進行數據庫同源搜索，進行相關功能注釋，搜索的期望值(E值)設定為 10－5。用于搜索的數據庫有 NR(the NCBI nonredundant)數據庫，Swiss－Prot(swissprot protein database)數據庫和KOG(eukaryotic ortholog groups)數據庫。此外，采用Blast2go 軟件［11］對 unigene進行基因本體論(gene ontology，簡稱 GO)注釋，并采用 WEGO 網站［12］(http://wego.genomics.org.cn/cgi－bin/wego/index.pl)作 GO 功能分類統計，從宏觀上認識繡球藤的基因功能分布特征。

1.4 SSR位點搜索和引物設計

采用 MISA(MIcroSAtellite identification tool，http://pgrc.ipk－gatersleben.de/misa/)對 unigene進行 SSR位點查找。查找的原則為所有SSR位點為一至六核苷酸的堿基重復類型，其中單核苷酸重復次數最少為10次，二核苷酸重復次數至少為6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數至少為5次。

2 結果與分析

2.1 繡球藤轉錄組數據的組裝結果

采用Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺對繡球藤葉片轉錄組進行測序，共得到原始reads 92 042 086個，經過濾后的reads數為80 406 986個，過濾后用于組裝的數據量約為8 GB。隨后，通過Trinity軟件進行無參拼接并用CD－HIT軟件進行聚類以及冗余序列的去除。經過拼接及聚類，最終得到的繡球藤轉錄組unigene的長度分布情況(圖1)?？偣搏@得202 340個unigene，長度分布于201～19 415 bp之間，平均長度為642 bp，N50(按照長度將拼接轉錄本從大到小排序，累加轉錄本的長度為總長50%的拼接轉錄本長度)為646 bp。

2.2 unigene的功能注釋、分類和代謝途徑分析

2.2.1 數據庫同源比對及注釋 對聚類后得到的轉錄本進行NR數據庫、Swiss－Prot數據庫和KOG數據庫同源比對及注釋。在E值為10－5的條件下，共95 586個unigene與3個數據庫序列具有同源性，占總數量的47.24%。與NR數據庫序列有同源性的 unigene最多，共 94 904個，占總數的46.90%，其中64 655個(31.95%)的 unigene與 NR 數據庫有較高同源性(E≤ e－50)。其次是KOG數據庫，共24 774個unigene分類至24個功能，占總數的12.24%。在這些功能分類中，只能大致預測功能的 unigene數量最多，3 957個unigene，占15.97%，其次是翻譯后修飾、蛋白質轉運和分子伴侶功能，2 042 個 unigene，占 8.24%;1 765(7.12%)個unigene具有翻譯，核糖體結構的功能;1 388個 unigene(5.61%)具有糖類運輸及代謝功能;1 025個 unigene(4.14%)具有氨基酸轉運及代謝功能，最少的功能分類為細胞運動性功能，僅0.1%unigene具有該功能。3個數據庫中，比對后同源性最低的為Swiss－Prot數據庫，僅65 288個unigene與該數據庫具有同源性，E值大多分布在e－150～e－5之間。

2.2.2 GO功能分類 GO是一套國際標準化的基因功能描述的分類系統。根據功能，GO可分為三大類:細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biological process)，分別用來描述基因編碼的產物所處的細胞環境、所具有的分子功能及所參與的生物過程。采用Blast2go軟件對unigene進行GO注釋，并采用WEGO網站作GO功能分類統計，可得到圖2結果。所有unigene中，可將64 542個unigene劃分至三大類38個功能亞類，其中22 166個unigene具有細胞組分功能，27 092個unigene具有分子功能，15 288個unigene具有生物過程功能(單個unigene可同時具有多個功能)。從三大類來看，細胞組分大類中，具有細胞和細胞組成功能的unigene最多;分子功能大類中，具有綁定、催化活性功能的unigene最多;而生物過程大類下，具有細胞過程和代謝過程的unigene數量最多。通過基因功能注釋過程，可從宏觀上認識繡球藤的基因功能分布特征，為后期的研究奠定基礎。

2.2.3 unigene的COG功能分類 對繡球藤unigene的蛋白質直系同源數據庫(cluster of orthologous groups，簡稱COG)功能分類結果表明，繡球藤注釋到COG的unigene根據功能大致可分為26類，并對每類的unigene數量進行統計分析，結果見圖3。其中，一般功能預測類基因最多(7 978個);其次是翻譯后修飾、蛋白質折疊和分子伴侶類基因(1 986個)及信號轉導機制(1 800個);而細胞活性(8個)和未知功能(1個)的基因較少。

2.2.4 unigene的KEGG分析 筆者所在實驗室對KEGG注釋結果作了分類統計，根據參與的KEGG代謝通路，將基因分為5個分支。其中，細胞過程552個，環境信息處理449個，遺傳信息處理1 330個，代謝2 282個，有機系統772個。由圖4可知，在所有的注釋中數量最多的3個分類為翻譯550個，碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)515個，信號轉導(signal transduction)360個(圖4)。這些注釋為后續次生代謝物的合成和代謝提供了很多有價值的信息。

2.2.5 SSR分析 對組裝后的繡球藤202 340個unigene進行SSR位點搜索，共檢測到10 255個SSR位點。通過位點搜索，沒有發現六核苷酸重復類型。其中，單核苷酸重復為5 224個，占50.94%;二核苷酸重復為2 590個，占25.26%;三核苷酸重復為1 952個，占19.03%;四核苷酸、五核苷酸重復所占比例較低，分別僅有58、13個。另外在檢測到的SSR位點中，復合SSR出現了418個。由于單核苷酸SSR位點在實際運用中較難統計，因此在基序統計中去除了單核苷酸重復的位點，結果顯示，二堿基重復出現頻率最高的3類基序為GA(540個)、AG(485個)、TC(396個);三堿基重復出現頻率最高的3類基序為GAA(115個)、AGA(111個)、AAG(110個)。上述SSR特征分析有助于開展繡球藤及其鐵線蓮屬植物的微衛星序列差異分析、分子標記開發和高密度遺傳圖譜構建的研究。

3 結論

利用Illumina測序平臺對繡球藤葉片的轉錄組進行測序和分析，首次揭示了繡球藤轉錄組的基本表達模式，初步獲得了一批在繡球藤葉片中表達的基因序列信息，共獲得202 340條質量較高的unigene，其中得到注釋的有95 586條，表明鐵線蓮屬植物存在大量的未知功能基因，為深入開展藥用植物生物活性成分的合成和鑒定提供了豐富的數據資料。在利用現代分子生物學技術提高天然藥用植物有效成分產量以及相關藥物研發和生產方面，具有重要的理論和應用價值。另外，筆者所在實驗室發現的繡球藤SSR位點能開發出大量適用于繡球藤的分子標記，為今后分子標記輔助育種及群體遺傳學研究提供了第一手研究資料，并且結合這些unigene基因信息和SSR位點能對鐵線蓮屬植物的系統進化研究提供幫助。