擬南芥自噬蛋白ATG8e的原核表達及多克隆抗體制備

劉 希，李遠鳳，齊亞飛，郁 飛

(旱區逆境生物學國家重點實驗室/西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100)

自噬(autophagy)是真核生物中進化保守的、對細胞內物質如蛋白質或細胞器進行降解、促進物質循環利用的重要過程［1－2］。在自噬發生的過程中，生物體先形成1個自噬吞噬泡(phagophore)，將細胞質物質包裹起來，吞噬泡逐漸形成1個雙層膜自噬體(autophagosome)，其外膜會與液泡膜融合，內膜及其包裹物(autophagic body)進入到液泡腔被水解酶分解［3］。研究表明，一系列自噬基因(autophagy－related genes，簡稱ATG)會組成功能單元參與自噬進程，如其中參與成膜過程的2個類泛素化系統——ATG8耦合系統［4］和ATG12耦合系統［5－6］。ATG8蛋白在自噬中發揮作用是一個類泛素化的過程，ATG8蛋白前體的C端被ATG4剪切，使其C端甘氨酸殘基暴露，接著被剪切后的ATG8會在ATG7(E1類似酶)催化下結合 ATG3(E2類似酶)，然后在 ATG12－ATG5·ATG16(“－”代表共價結合，“·”代表非共價結合)復合物(E3類似酶)作用下，ATG8可以與磷脂酰乙醇胺(PE)連接組成ATG8－PE［4］。ATG8－PE錨定于自噬體膜上，參與自噬體膜的形成［7］。因此可根據ATG8－PE的積累量來衡量植物的自噬程度，從而比較不同基因型植物之間自噬發生的差異，篩選能參與自噬調控途徑的新基因，對于揭示植物自噬的分子途徑具有重要意義。

自噬在植物的生長發育和脅迫響應中發揮重要作用。研究表明，擬南芥中至少有36個基因與酵母ATG基因同源且具有相似作用，參與植物的免疫反應［8］、葉片衰老及環境脅迫應答等［9］。為了研究植物自噬，以 ATG8家族9個成員(ATG8a～ATG8i)［10］之一的 ATG8e作為切入點，構建 ATG8e基因的原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，用異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ－D－thiogalactoside，簡稱IPTG)誘導產生融合蛋白GST－ATG8e，最后用切去谷胱甘肽S移換酶(glutathione S－transferase，簡稱 GST)標簽并純化過的ATG8e免疫家兔，心臟采血后收集血清，制備多克隆抗體。為證明制備的多克隆抗體的有效性，構建重組質粒pBI111LATG8e，利用花序侵染法［11］轉化野生型擬南芥，得到ATG8e超表達植物，提取野生型擬南芥和ATG8e超表達植物葉片總蛋白，用于免疫印跡檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物、細菌和載體 野生型擬南芥Columbia(Col)、大腸桿菌TOP10菌株、大腸桿菌BL21(DE3)菌株、野生型擬南芥 cDNA、農桿菌 GV3101菌株、二元載體 pBI111L［12］、原核表達載體pGEX－4T－1均由筆者所在實驗室留存。

1.1.2 試劑 高保真 DNA聚合酶(PrimeSTAR?HS DNA Polymerase)，Bam H I和Eco R I內切酶、T4DNA連接酶購于TaKaRa公司;DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)、質粒小提試劑盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)購于天根生化科技(北京)有限公司;異丙基－β－D－硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑(Freund's adjuvant complete)和弗氏不完全佐劑(Freund's adjuvant incomplete)購于Sigma公司;GST標簽蛋白純化柱填料protein Glutathione Sepharose 4 Fast Flow、凝血酶(Thrombin)、表面活性劑(SILWET?L －77)、0.45μm硝酸纖維素(Nitro Cellulose)膜購于GE Healthcare Life Science;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，簡稱IgG)購于北京康為世紀生物科技有限公司;尿素購于Amresco公司;ECL工作液(Detection reagent 1，Detection reagent 2)購于 Bio－Rad公司;特異性引物由上海立菲生物技術有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 原核表達載體pGEX－4T－1－ATG8e的構建 根據擬南芥官方網站TAIR(https://www.arabidopsis.org/)公布的ATG8e基因序列，設計引物:

F和R中下劃線的堿基序列為Bam HⅠ的酶切位點。以野生型擬南芥cDNA為模板，以F和R為上下游引物擴增ATG8e片段。PCR程序:94℃ 2 min;98℃ 10 s，53℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環;72℃ 2 min。將PCR擴增產物ATG8e用Bam H I酶切后連至原核表達載體pGEX－4T－1，用轉化CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞TOP10，挑取生長正常的單菌落搖菌，提質粒進行酶切驗證，將鑒定結果正確的質粒送華大基因測序。

1.2.2 融合蛋白GST－ATG8e的誘導表達和純化 將測序正確的重組質粒pGEX－4T－1－ATG8e轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取生長正常的單克隆于含有100μg/mL氨芐青霉素的2×YT(16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，15 g/L NaCl)液體培養基中，37℃、220 r/min培養至菌液D600nm約為0.8時，加誘導劑IPTG，使其在菌液中的終濃度為1 mmol/L，20℃、220 r/min誘導表達約20 h;4℃、8 000 r/min離心10 min收菌，菌體沉淀用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，簡 稱 PBS)(140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4·7H2O，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 值7.3)重懸;超聲破菌后，4℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀，后者用PBS重懸。取誘導前菌液、誘導后菌液、破菌后上清液、破菌后沉淀各50μL，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS－PAGE)檢測融合蛋白GST－ATG8e的表達情況。電泳結束后，用半干轉膜儀將蛋白樣品轉到0.45μm NC膜上并用麗春紅對膜瞬時染色，之后用 TBST 緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl，pH 值 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween －20)洗去浮色，室溫條件下用封閉液(含0.05 g/mL脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉1 h，加入用封閉液稀釋的Anti－GST(1∶5 000)4℃過夜孵育，次日用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，加入用封閉液稀釋的羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入ECL顯色液用化學發光凝膠成像系統成像。

收集同樣條件下用 IPTG誘導的菌液400 mL，4℃、8 000 r/min離心10 min;菌體沉淀用20 mL PBS重懸;超聲破菌后，4℃、12 000 r/min離心 30 min，收集上清液并用0.45μm濾膜過濾;將過濾后的上清液與1 mL GST標簽蛋白純化柱填料protein Glutathione Sepharose4 Fast Flow于室溫孵育1 h，4℃、3 000 r/min離心10 min;用10個柱體積的PBS洗滌柱上雜蛋白，4℃、3 000 r/min離心10 min;加入50μL凝血酶(1 U/μL)于950μL PBS中，柱上切除標簽蛋白(室溫12～16 h)，4℃、3 000 r/min離心10 min收集酶切后的蛋白;用1 mL還原型谷胱甘肽(20 mmol/L)洗脫液洗脫標簽蛋白。收集每步樣品50μL進行SDS－PAGE鑒定［13］。為了得到更純凈的目的蛋白，后續對ATG8e進行SDS－PAGE割膠純化，并以牛血清白蛋白(BSA，質量濃度梯度依次為 1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL)為對照，對其濃度進行分析評估［14］。

1.2.3 ATG8e抗血清的制備及驗證 購買3只飼養2個月的健康成年家兔，初免家兔的抗原是等體積ATG8e蛋白與弗氏完全佐劑的混合物，免疫劑量為200μg/只。第14天后進行第2次免疫，第28、第42天分別進行第3、第4次免疫，第2、3、4次加強免疫家兔所用抗原是等體積ATG8e蛋白與弗氏不完全佐劑的混合物［15］，免疫劑量為100μg/只。3次加強免疫之后，對家兔心臟采血，將其血液于37℃放置1 h，4℃冰箱過夜，4℃、14 000 r/min離心10 min，收集血清并分裝，于 －80℃ 儲存備用。

分別吸取0.3、3、30 ng純化后的ATG8e蛋白進行SDSPAGE。以ATG8e兔抗血清(1∶1 000)為一抗，羊抗兔IgG(1∶10 000)為二抗，進行免疫印跡檢測。

1.2.4 純化 ATG8e兔抗血清 取約 0.6 mg純化后的ATG8e進行SDS－PAGE;電泳結束以后，用半干轉膜儀將蛋白樣品轉到 0.45μm NC膜上;在室溫條件下，用含0.05 g/mL 脫脂奶粉的 TBS緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl，pH值 7.4，500 mmol/L NaCl，0.05%Tween －20)將抗原結合區域封閉1 h;之后將膜切成約為2 mm2小方塊，裝入含有ATG8e抗血清的離心管中，4℃過夜孵育;次日用TBS緩沖液洗膜3 次，每次 5 min;用PBS(20 mmol/L Na3PO4，pH 值 7.2，150 mmol/L NaCl)洗膜3次，每次5 min;加入500μL洗脫液(100 mmol/L甘氨酸，pH值2.5)，室溫孵育10 min;吸取洗脫液甘氨酸于新的1.5 mL離心管中，加入50μL 1 mol/L Tris－HCl(pH值8.0)，彈甩混勻，測濃度并分裝后于－80℃儲存備用。

1.2.5 ATG8e超表達植物的獲得

1.2.5.1 構建pBI111L－ATG8e重組載體 用限制性內切酶Bam HⅠ從pGEX－4T－1－ATG8e上切下ATG8e基因片段，連接到同樣用Bam HⅠ酶切的載體pBI111L上，用轉化CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞TOP10，挑取生長正常的單菌落搖菌，提質粒酶切驗證。

1.2.5.2 花序侵染法轉化野生型擬南芥植株 將重組質粒pBI111L－ATG8e電擊轉化農桿菌GV3101菌株，挑取單克隆于加入50μg/mL慶大霉素、50μg/mL卡那霉素、25μg/mL利福平的LB液體培養基中，28℃、220 r/min培養，至D600nm約為1.2時收菌;菌體用500 mL滲透緩沖液［5%蔗糖(質量濃度)，0.05%(體積分數)SILWET?L －77］重懸;將側枝豐富的野生型擬南芥植株進行蘸花，時間約為45 s;蘸花后植物上收取的種子為轉基因T1代。

1.2.5.3 ATG8e超表達T3代植物的獲得 T1代植株用含有50μg/mL卡那霉素的MS培養基初篩，將挑出的綠色植物移栽到基質土上繼續生長，待植物果莢成熟后，單顆收取T2代種子;T2代轉基因植株的鑒定主要從蛋白水平上檢測ATG8e的表達，挑選出ATG8e高表達植株單株收取T3代種子;對T3代植株分別從ATG8e RNA轉錄水平以及蛋白表達水平進行檢測。

1.2.6 ATG8e多克隆抗體特異性檢測 取在基質土上生長3周齡的野生型擬南芥和ATG8e超表達T3代植株葉片于1.5 mL離心管內并稱質量。將各組植物樣品研磨成粉末，1 mg植物量加入10μL蛋白提取液(125 mmol/L Tris－HCl，pH 值6.8，20%甘油，4%SDS，1% β － 巰基乙醇)，65 ℃干浴處理2 h，14 000 r/min離心10 min，吸上清液于新的1.5 mL離心管內，－80℃儲存備用。取10μL植物蛋白樣品進行尿素－SDS－PAGE(6 mol/L尿素)，用已制備的ATG8e多克隆抗體進行免疫印跡檢測。

2 結果與分析

2.1 鑒定pGEX－4T－1－ATG8e原核表達載體

將構建的原核表達載體pGEX－4T－1－ATG8e用Bam HⅠ酶切鑒定插入，得到5 000 bp的載體骨架和約為370 bp的目的片段(圖1的泳道1和泳道2)。之后用Eco RⅠ鑒定插入方向，瓊脂糖凝膠電泳呈現5 000 bp的載體骨架以及為約為300 bp的片段插入(圖1的泳道3和泳道4)，對插入方向為正向的2號重組質粒測序。測序結果完全準確，表明成功構建了pGEX－4T－1－ATG8e載體。

2.2 重組蛋白的誘導表達和純化

對誘導前菌液、誘導后菌液、破菌后上清液、破菌后沉淀4個樣品進行SDS－PAGE(圖2)。在誘導后菌液和破菌后的上清液樣品中均檢測到高表達量的蛋白條帶(37～50 ku)(圖2的泳道2和泳道3)，說明該蛋白在試驗條件下是可誘導的，且大部分是以可溶性形式存在的。已知GST－ATG8e分子量理論值為40 ku，根據膠圖結果推測極有可能成功誘導表達了融合蛋白GST－ATG8e;為進一步確定誘導高表達的為融合蛋白GST－ATG8e，用Anti－GST做免疫印跡，檢測到大小和融合蛋白GST－ATG8e分子量吻合的特異性條帶，說明融合蛋白GST－ATG8e在大腸桿菌中成功表達。

將融合蛋白GST－ATG8e經谷胱甘肽瓊脂糖凝膠樹脂親和純化，用凝血酶酶切去除GST標簽，之后對ATG8e進行SDS－PAGE割膠再純化。用 BSA(質量濃度依次為1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL)定量，測得 ATG8e 質量濃度約為0.3 mg/mL(圖3)。

2.3 ATG8e多克隆抗體的效價檢測和制備

用分離純化得到的ATG8e蛋白免疫家兔，收集免疫4次后的兔抗血清做免疫印跡檢測。結果顯示，1∶1 000稀釋后的ATG8e兔抗血清能清晰檢測到3 ng ATG8e蛋白(圖4)。證明兔抗血清效價比較高，后續可以純化抗血清制備高質量的ATG8e多克隆抗體。

2.4 ATG8e多克隆抗體對擬南芥內源ATG8e蛋白的特異性檢測

提取3周齡野生型擬南芥和2#、3#ATG8eOE(OE表示基因過表達)T3代植株葉片cDNA，做半定量PCR檢測ATG8e在2種基因型植株中的表達水平(圖5)，以UBQ10作為內參。結果顯示，2#、3#ATG8eOET3代植株ATG8e的表達量相較于野生型擬南芥植株明顯增多。之后提取野生型擬南芥和2#、3#ATG8eOET3代植株葉片蛋白，每孔上樣10μL進行Urea－SDS－PAGE(6 mol/L Urea)電泳，Anti－ATG8e多克隆抗體免疫印跡檢測結果如圖6所示。以野生型擬南芥為對照，2#、3#ATG8eOET3代植株葉片蛋白樣品中 ATG8e和ATG8e－PE的積累量明顯上調，盡管ATG8e－PE分子質量比ATG8e大，但是由于ATG8e－PE疏水性極強，其遷移率較ATG8e快［16］;對應的是其考馬斯亮藍染液染膠結果，表明樣品上樣量一致性很高。這說明制備的ATG8e多克隆抗體能夠特異性識別擬南芥內源ATG8e。

3 討論與結論

已有報道表明，自噬相關基因在真核生物進化中高度保守［10］，說明自噬對于機體正常有序的生命活動具有重要意義。在動物中，自噬與癌癥、神經衰退型疾病、長壽有關［17］。在植物體中，自噬與脅迫響應［8］、病原體侵害［18］、衰老［19］相關。ATG8基因在細胞自噬過程中發揮了重要作用，由于ATG8家族的ATG8e在細胞內主要以ATG8e和ATG8e－PE這2種形式存在，后者可以通過PE基團錨定在自噬體膜上，參與自噬體成膜過程［7］，ATG8e－PE的積累量能夠表征植物個體自噬發生的程度。通常檢測植物體自噬的分子標記有2種，一是單丹磺酰尸胺染色［20］，它的缺點是可以使自噬體及所有酸性液泡都被染色，屬于非特異性的，不是最佳自噬檢測方法。二是ATG8蛋白的N端加綠色熒光蛋白GFP［20－22］，可以在熒光顯微鏡下觀察ATG8的定位，也可以利用GFP多克隆抗體做免疫印跡檢測GFP－ATG8和剪切后游離的GFP積累量，間接估計自噬的程度，還可以用ATG8e蛋白多克隆抗體檢測植物內源ATG8e和ATG8e－PE積累量，這對于研究自噬很有價值。另外，利用制備的ATG8e多克隆抗體做免疫印跡，可檢測不同基因型擬南芥植株在非生物脅迫響應，如營養饑餓、氧脅迫、干旱等條件下，不同藥物如刀豆素 A(concanamycin A)、E－64d、BTH 等處理時 ATG8e和ATG8e－PE的積累量，從而表征植物自噬發生的程度，是研究植物體自噬的有效工具。

本研究構建重組質粒pGEX－4T－1－ATG8e，在大腸桿菌系統下誘導表達融合蛋白GST－ATG8e，但引進標簽GST所占比例過大，可能會影響目的蛋白活性，決定用切除標簽GST的ATG8e蛋白免疫健康成年家兔制備多克隆抗體。本試驗采用凝血酶酶切40 ku融合蛋白GST－ATG8e，將其分為14 ku的ATG8e和26 ku的GST 2個部分，14 ku的ATG8e因無GST結合位點，故從GST柱上流穿，而帶有26 ku GST標簽的融合蛋白會結合在柱子上，這樣就可以將目的蛋白ATG8e與融合蛋白GST－ATG8e成功分離［23］。為了得到高效價的ATG8e蛋白，不僅先用GST柱親和純化，還將凝血酶處理的目的蛋白進行SDS－PAGE割膠再純化。最后在檢測植物內源ATG8e表達量時，不僅用了野生型擬南芥植株，還采用ATG8e過表達材料ATG8eOET3代充分證實制備的ATG8e多克隆抗體有效。