油菜菌核病抗性鑒定方法比較及抗病種質資源的篩選

何烈干，宋來強，湯 潔，周銀生，馬輝剛

(1.江西省農業科學院植物保護研究所，江西南昌330200;2.江西省農業科學院作物研究所，江西南昌330200;3.江西省弋陽縣植保植檢站，江西弋陽334400)

油菜菌核病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染引起的一種世界性真菌病害，位居油菜三大病害之首［1］。該病在我國各個油菜產區都有發生，在長江流域發生尤為嚴重，在江西省發病率一般在15%～35%之間，重病年份損失可達80%以上，種子含油量平均降低5%以上，給農業生產造成巨大的經濟損失［2－3］。目前防治菌核病的傳統措施是施用化學藥劑，但由此造成的環境污染問題越來越嚴重，且因長期大量使用化學藥劑，該病已對一些傳統藥劑(如多菌靈)產生了抗藥性。培育優良的抗病品種是防治油菜菌核病既經濟、有效又安全的措施［4－6］。因此在油菜雜交育種中對菌核病抗性鑒定和抗病品種的篩選顯得尤為重要，而鑒定方法的選用又是其關鍵環節［7］。目前，國內外對油菜菌核病的抗性鑒定方法的研究較多［8－12］，而對這些方法優缺點作系統比較并進行品種抗性鑒定與評價的研究鮮有報道。以往的研究報道中，如常用的牙簽法是以人為破壞植株組織結構為基礎的，所得研究結果較菌核病的自然侵染存在一定的差異，因此本研究以多種抗感品種為基礎采用幾種常用且有效的油菜菌核病抗病性鑒定方法進行系統比較，明確各種方法的優缺點，從中篩選出一種準確可靠有效的鑒定方法，為油菜菌核病抗性品種資源的有效篩選提供理論依據，并依據此法對25份油菜種質材料進行菌核病抗性鑒定，為抗病育種提供抗源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秦優七號等25個油菜品種用于抗性鑒定方法的比較，25份育種材料用作抗源的篩選，以上種質資源由江西省農業科學院作物研究所提供。

1.2 試驗設計

用于抗病性鑒定方法比較的材料播期為2015年10月12日，播種方式為種子直播，采用隨機區組設計，每小區20 m2，3個重復。用于抗源篩選的材料的播期為2015年10月18日，播種方式為種子直播，采用隨機區組排列，小區面積15 m2，試驗設3個重復，按生產常規管理。

1.3 供試菌株

2015年4月底在江西省農業科學院良種場油菜地采集菌核，經表面消毒后，接種于PDA平板，在25℃條件下培養4～6 d至長出菌絲進行純化鑒定，最后轉至PDA斜面置于4℃ 保存備用。

1.4 抗性鑒定方法

1.4.1 花期瓊脂塊葉腋接種法［13］將備用的供試核盤菌菌絲取出，經PDA培養基繼代培養后，置于25℃光照培養箱中培養3～4 d，待菌絲充分生長后用打孔器沿菌落邊緣打孔成6 mm的菌絲圓片，然后將1個圓片和浸濕的棉花包在一起，用透明膠布綁在盛花期油菜的相同葉位的葉腋處，注意密封保濕，并每天定期噴水，7 d后量取病斑長度，14 d后再次量取病斑長度，病情分級的評價采用0～9級標準:0級，健康植株;1級，病斑長度僅出現在接種點處，無擴展;2級，表面侵染面積達莖稈面積的25%;3級，表面侵染面積達莖稈面積的50%;4級，表面侵染面積達莖稈面積的75%;5級，病斑傷害深度達莖稈直徑的25%;6級，病斑傷害深度達莖稈直徑的50%;7級，病斑傷害深度達莖稈直徑的75%;8級，整個植株嚴重受害，出現大面積的白色病斑;9級，植株死亡。

1.4.2 草酸浸根法 待供試品種長至5葉期時，選取大小相同的連根健康幼苗，用清水沖洗干凈，放入盛有150 mL(濃度15 mmol/L)草酸溶液的燒杯中。試驗設3次重復，每次25株幼苗和對照品種(低感品種)隨機排列置于22℃空調房內。用薄膜罩住幼苗使其保濕，每隔12 h向薄膜噴1次水，每12 h補加1次草酸溶液至150 mL，以保證致病濃度。當對照品種開始發病時作第1次調查，對照品種大部分植株半數葉片萎蔫時作第2次調查，每次均分級記載。

病情分級標準按劉勝毅等的5級分級法［14］:0級，無病狀;1級，葉尖病變;2級，全株半數以下葉片的葉身病變;3級，半數及其以上葉片的葉身病變，或半數及其以下葉片的葉柄病變;4級，半數以上葉片的葉柄病變;5級，全株葉柄病變。根據病害級別求病情指數DI=［∑(ng)/(5N)］×100。式中:g為病害級別，n為每級別中植株數，N為植株總數，5為最高病級。

1.4.3 營養生長期瓊脂塊離體葉片法 當供試品種長至6～7葉期時，每個品種選大小相同的植株，每株選取大小和葉位相同的健康葉片1張備用。每個品種接種5張葉子，每張葉片2個接種點，重復3次。準備若干個塑料飯盒，每個飯盒底部鋪2張濾紙，在飯盒中加入20 mL蒸餾水，將濾紙浸透，把備用的葉片分別平鋪于飯盒中。將備用的菌種菌絲取出，接種于PDA平板上，置于25℃下擴大培養3 d后，用直徑6 mm打孔器在菌落邊緣打孔成菌絲圓片。挑取菌絲圓片接種到油菜葉片上，2個接種點在葉片中部沿葉脈呈軸對稱，蓋上蓋子，水平放置在25℃光照培養箱內。每隔24 h測量1次病斑直徑，共測4次，按5級標準［2］調查發病情況:0級，無病;1級，病斑面積占全葉面積的10%以下;2級，病斑面積占全葉面積的11% ～30%;3級，病斑面積占全葉面積的31% ～50%;5級，病斑面積占全葉面積的51%以上。

1.4.4 盛花期牙簽莖稈接種法 參照劉勇等的火柴棍莖稈接種法［15］，將牙簽置于盛有PD培養液的燒瓶中，浸泡24 h后滅菌備用。將供試菌株接種到PDA培養基中，把備用的牙簽呈放射狀均勻擺放在圓片周圍，每個培養皿10根。當油菜處于盛花期時，選用健康的植株，用直徑為3 mm的消毒鐵釘在離地面30 cm左右處打孔，然后把接種體插入孔中，每個品種接種20株，試驗設3次重復，接種后觀察病斑沿莖稈方向的擴展情況，每7 d量取1次病斑長度，共調查2次。

1.4.5 初花期活體葉片菌絲塊接種法 待油菜苗長至初花期時，將備用的菌株菌絲轉接至PDA培養基中，培養5 d后，用打孔器沿菌落邊緣打孔成6 mm的菌絲圓片，帶菌絲的一面貼在油菜植株的相同部位較嫩葉片上，用透明膠封住圓片以保濕。接種后24 h保證溫度在25℃左右并噴水，5 d后進行病害調查［16］，發病情況分級同“1.4.3”節的方法。

1.4.6 大田接種鑒定法 供試的25個油菜品種播種時1 m2土壤施2粒菌核，試驗設3個重復。參考李麗麗等的方法［17］，于成熟期分級調查病害。

1.5 統計分析方法

參考周必文等的方法［18］，以對照發病株率為選擇壓力標準，田間鑒定為 ＞10%、＜100%;接種鑒定為 ＞40%、＜100%。符合選擇壓力標準為有效鑒定，以有效鑒定試驗結果統計抗病率，抗病性以抗病率(RR)表示:RR=(CK－M)/CK。式中:CK為對照病害值，M為鑒定目標病害值。

花期瓊脂塊葉腋接種法、草酸浸根法和大田接種鑒定法這3種方法中，油菜品種的抗病性差異用病情指數表示，營養生長期瓊脂塊離體葉片法和初花期活體葉片菌絲塊接種法用病斑直徑表示，而盛花期牙簽莖稈接種法用莖稈上的條形病斑長度表示油菜品種抗病性高低?；ㄆ诃傊瑝K葉腋接種法、草酸浸根法和盛花期牙簽莖稈接種法這3種方法的結果是第2次調查的平均值，營養生長期瓊脂塊離體葉片法的結果是96 h后的調查的平均值。在相同方法下進行品種間的差異顯著性檢驗。

1.6 油菜抗源的篩選

采用初花期瓊脂塊葉片接種法，對25份育種材料進行菌核病抗性鑒定與篩選，試驗設3次重復，每份材料鑒定20株。

2 結果與分析

2.1 抗病性鑒定方法的比較

2.1.1 不同方法的鑒定結果 由表1可知，25個品種在6種鑒定方法中的抗感性都存在不同程度的差異，以最為接近自然條件下發病程度的大田接種法為基準，草酸浸根法和營養生長期瓊脂塊離體葉片法的結果之間差異相對不太顯著，而花期瓊脂塊葉腋接種法、初花期活體葉片菌絲塊接種法和盛花期牙簽莖稈接種法均表現出顯著性差異，即苗期品種間的抗感性差異較小，成株期品種間的差異較為顯著。

表1 不同方法對未知抗、感品種抗性的鑒定結果

油菜菌核病在苗期和成株期均可發生，成株期發生和危害都較苗期嚴重，因而成株期抗性水平是品種抗性評價的主要指標。在苗期瓊脂塊離體葉片法中，中雙9號、華湘油12號和油研50表現為較高的感病性，而在花期瓊脂塊葉腋接種法、初花期活體葉片菌絲塊接種法和盛花期牙簽莖稈接種法中表現較強的抗性，南油68和華油雜13號在苗期表現為抗病性，而在成株期卻表現為感病性，苗期鑒定結果與成株期不一致，苗期鑒定方法與成株期鑒定方法存在著差異。

以最接近田間發病條件的大田接種法為對照，在抗感性鑒定結果較為接近真實田間發病狀況的花期瓊脂塊葉腋接種法、初花期活體葉片菌絲塊接種法和盛花期牙簽莖稈接種法等3種方法中，綜合對比發現，以初花期活體葉片菌絲塊接種法的抗感性鑒定結果與大田接種法最接近，本試驗得出的幾種方法之間差異顯著性結果與冉毅等的結論［27］較為一致。另外，試驗所選品種陽光2009在花期牙簽莖稈接種法中表現出高感病性，而在其余5種方法中卻表現為較高的抗病性，這可能是由于陽光2009抗擴展而不抗侵染，牙簽接種人為破壞了表皮組織使得病菌得以侵入。

2.1.2 不同鑒定方法的相關性 將表1的結果轉化成病情指數，由病情指數分析得到不同鑒定方法之間的相關系數。結果(表2)顯示，不同的鑒定方法之間既有正相關，也有負相關。初花期活體葉片菌絲塊接種法、花期瓊脂塊葉腋接種法和盛花期牙簽莖稈接種法與大田接種法之間的相關系數分別為 0.954 0、0.941 6、0.860 4，均達到了極顯著水平，是可靠的人工接種鑒定法。營養生長期瓊脂塊離體葉片法與大田接種法之間的相關系數是－0.078 5，草酸浸根法與大田接種法之間的相關系數為0.229 2，這2種方法與大田接種法存在著較大的出入，可知不是可靠的人工接種方法。因此從上面5種人工接種鑒定方法的試驗結果來看，油菜菌核病不同鑒定方法之間接種實際效果不同，在進行油菜菌核病的抗性鑒定試驗中，應當選擇一種最接近菌核病田間真實發病情況的接種方法。

2.2 抗源篩選

根據上述研究結果，選用初花期活體葉片菌絲塊接種法對25份材料進行鑒定。以贛油雜7號為對照，采用接種后5 d調查到的數據進行材料間抗病性差異比較。結果(表3)顯示，供試材料間抗、感差異顯著，3M017、3M005、3M013、3M021等對菌核病的抗性較對照差，其差異達到顯著水平;3M011、3M022 等與對照抗性相當;3M009、3M020、3M012等抗性高于對照，其差異達到顯著水平。根據抗性鑒定結果可知，3M009和3M020的抗病率在0.3以上，顯著高于對照，是很好的高抗材料，3M012、3M004、3M018、3M024 和3M007的抗病率在0.05～0.20，顯著高于對照，也是較好的抗性材料。

表2 不同鑒定方法之間的相關系數

表3 25個油菜材料抗性鑒定結果

3 討論與結論

本試驗采用了6種接種方法鑒定了25個品種對油菜菌核病的抗性，結果表明，不同的抗性鑒定方法之間效果不同。與已有研究報道不同的是，本試驗采用了多個抗感品種作為鑒定對象，避免了因品種數量少而使結果存在著一定的偶然性誤差，且所選品種的抗性未知，從而更加全面準確地比較了各種方法之間的相關性和優缺點。

草酸浸根法在油菜苗期抗菌核病材料的篩選中應用較為廣泛，在育種材料早期鑒定中起到了較好的作用，省力省時，研究報道較多［19－20］。但在本研究方法中，其與大田接種法之間的相關性不顯著，其原因可能是由于油菜成株期后抗感性發生了改變。營養生長期瓊脂塊離體葉片法是利用離體葉片所進行的鑒定方法，該法不影響作物生長發育，可以保護珍貴的育種材料，具有周期短、成本低、見效快的優點，目前應用較為廣泛，在本試驗中該法與其他幾種方法之間相關性不顯著，因為其在離體條件下進行，不能反映活體的狀況。上述2種方法反映出苗期抗性與成株期抗性存在差異，其是否適合油菜抗性鑒定還有待于進一步驗證。

本試驗的3種成株期鑒定方法與大田接種鑒定呈顯著正相關，是可靠的鑒定方法。這3種方法中，初花期活體葉片菌絲塊接種法與大田接種法相關性最高，是最可靠的鑒定方法，這與一些研究報道有差異，花期瓊脂塊葉腋接種法次之，盛花期牙簽莖稈接種法稍差，雖然其病斑長度差異較為顯著，但因為其破壞了植物的表皮組織，極少數品種存在著抗侵染不抗擴展現象，從而導致結果存在著一定的誤差?，F有相關研究表明，作物上抗性基因表達存在時空差異，苗期鑒定結果不一定能反映成株期或花期的結果。因此對油菜菌核病的接種鑒定，應以成株期的鑒定尤以初花期活體葉片菌絲塊接種法為可靠鑒定法。

對油菜的接種鑒定法除了本研究提到的6種外，還有草酸浸葉法、菌絲培養液浸根法、子囊孢子接種法、氣候室盆栽接種鑒定和無菌法等。子囊孢子接種法可以在一定程度上模擬自然侵染過程:子囊盤彈射出子囊孢子附著在花瓣上，子囊孢子通過花瓣去侵染葉片和莖稈，但是在操作過程中，子囊孢子的收集較麻煩，接種數量不好控制。草酸浸葉法與草酸浸根法相似，都與成株期的抗感性存在著一定的差異。

抗源是從事抗病育種的基礎，本試驗采用初花期活體葉片菌絲塊接種法對25份材料進行了鑒定，篩選到了7份抗性較好的材料，其中有2份材料的抗病率在0.3以上，是非常好的抗源材料。