金刺梨黑斑病病原菌生物學特性及室內藥劑毒力測定

張秀偉，蔡甫格，潘中濤，李用奇，鮑 菊

(貴州省安順市農業科學院，貴州安順561000)

金刺梨(Rosa sterilis var.)是貴州省特有的新興果樹，是刺梨的近緣種，屬薔薇科薔薇屬。2015年2月12日金刺梨通過植物新品種審定，定名為金果，是貴州省第1個植物新品種權，得到國家相關法律的保護。金刺梨果實富含維生素C、葉酸、胡蘿卜素、超氧化物歧化酶、人體所需氨基酸等，同時還含有抗白血病的天門冬氨酸，是一種食藥兼用的綠色保健食品，具有很高的商品價值與推廣價值。但由于金刺梨是一種野生果樹資源，馴化栽培歷史短，果農對其病蟲害不了解，在病蟲害發生時盲目用藥，不僅得不到有效防治，還提高了管理成本，造成很大的經濟損失。“十二五”期間貴州省安順市金刺梨的種植面積達1.3萬hm2，隨著種植面積的增加，金刺梨的病蟲害也日益嚴重。因此，對金刺梨的病蟲害進行相關研究，新確認2種病害，分別為黑斑病、褐斑病，其中黑斑病在局部區域發生，但病害一旦發生會直接導致金刺梨產量大幅度下降，黑斑病于金刺梨開花期發病，主要危害金刺梨幼嫩的果梗，初期在果枝上形成紫色不規則病斑，后期病斑連成片，形成黑色凹陷病斑，繞果枝一周，表皮干腐狀，染病后期輕輕觸碰果梗，整個花序全部脫落。采集黑斑病的病組織在室內保濕培養，發現有白色黏質團出現，證實該病主要由擬莖點霉屬(Phomopsis Sacc.)真菌侵染引起，本研究對該菌的生物學特性進行初步探討，并進行室內藥劑篩選試驗，以期為該病害的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

于2015年5月在貴州省安順市農業科學院金刺梨種植基地采集金刺梨黑斑病病樣，在貴州省安順市農業科學院微生物實驗室內進行病原菌的分離純化，通過回接試驗證明該菌為致病菌，經形態學和rDNA－ITS測序鑒定該菌為擬莖點霉屬辣椒擬莖點霉真菌(P.capsici)，在PDA培養基(200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，18 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水)斜面上保存備用。

1.2 供試藥劑

70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，購自日本曹達株式會社;75%百菌清可濕性粉劑，購自英國先正達有限公司;80%多菌靈可濕性粉劑，購自南京卓創化工有限公司;58%甲霜·福美雙可濕性粉劑，購自南京艾森精細化工有限公司;80%代森錳鋅可濕性粉劑，購自浙江省東陽農藥廠。

1.3 病原菌生長條件

1.3.1 不同溫度對病原菌生長的影響 在無菌條件下，用直徑為5 mm的打孔器打取在PDA培養基中培養7 d后的菌餅，菌餅要求生長一致，把菌餅接入PDA培養基平板中，分別放在 5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃恒溫培養箱中培養，培養5 d后，用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑，每個處理 3 次重復［1－2］。

1.3.2 不同pH值對病原菌生長的影響 用無菌NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)將PDA培養基的pH值分別調至 3、4、5、6、7、8、9、10，將直徑為 5 mm 的菌餅分別接入不同pH值的PDA培養基平板中，28℃恒溫培養，每個處理重復3次，培養5 d后測量菌落直徑。

1.3.3 不同培養基對病原菌生長的影響 將直徑為5 mm的菌餅分別接入PDA培養基、胡蘿卜培養基(100 g胡蘿卜、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、燕麥培養基(20 g燕麥、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、植物培養基(20 g金刺梨嫩枝葉、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、水瓊脂培養基(20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、察氏培養基(3.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸氫二鉀、0.50 g 硫酸鎂、0.50 g 氯化鈉、0.01 g 硫酸亞鐵、30.00 g 蔗糖、18.00 g瓊脂、1 000.00 mL 蒸餾水)中，放入 28 ℃恒溫培養箱中培養，每個處理重復3次，培養5 d后測量菌落直徑。

1.3.4 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響 以真菌生理培養基［3－4］(1.0 g 氮源、0.5 g 磷酸二氫鉀、5.0 g 碳源、20.0 g瓊脂、1 000.0 mL蒸餾水)為基礎培養基，將直徑為5 mm的菌餅接入不同碳源［果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、無碳源(CK)］、氮源［蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、甘氨酸、無氮源(CK)］的培養基中恒溫培養，每個處理重復3次，培養5 d后測量菌落直徑。

1.3.5 不同光照對病原菌生長的影響 取直徑為5 mm的菌餅，接入PDA培養基平板中，分別在連續光照(24 h光照)、間斷光照(12 h光照，12 h黑暗)、連續黑暗(24 h黑暗)條件下，于28℃恒溫培養，每個處理重復3次［5］，培養5 d后測量菌落直徑。

1.3.6 菌絲、孢子致死溫度的測定 分別在40、45、50、55、60℃恒溫水浴鍋的試管中加入1 mL用無菌水配制的孢子懸浮液;在加有2 mL無菌水的離心管中分別加入3塊直徑為5 mm的菌餅，處理10 min后，將其拿出冷卻，分別接種在PDA培養基平板上，每個處理重復3次［6］，放入28℃恒溫培養箱內培養，培養5 d后觀察并記錄菌絲、孢子的生長情況。

1.4 室內毒力測定

采用原藥室內生長速率法［7－8］進行藥劑篩選，測量5種供試藥劑對金刺梨黑斑病病原菌毒力的大小。將供試藥劑原藥用無菌水配制成所需濃度，每種藥劑設置5個濃度，取1 mL藥液加入9 mL PDA培養基中，搖勻后倒入直徑為8 cm的培養皿中，取出培養7 d的病原菌菌落，打取直徑為5 mm的菌塊，移入到加藥的PDA平板培養基中，每種藥劑每個濃度設置3次重復，以加入1 mL無菌水的PDA培養基平板為對照。培養5 d后測量菌落直徑，計算抑菌率、各藥劑的毒力回歸方程、抑制中濃度(EC50)。抑菌率=［(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑］×100%。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對菌落生長的影響

由表1可知，金刺梨黑斑病病原菌在10～35℃均可生長，結合菌落濃密度得出該菌適宜的生長溫度為20～30℃，在25～30℃條件下菌落生長較快，最佳生長溫度為28℃，此時菌落直徑達到9.33 cm，與其他溫度相比差異顯著(p＜0.05)，且菌落生長濃密。在溫度低至5℃或高至40℃時菌落不能生長。

表1 不同溫度對菌絲生長的影響

2.2 不同pH值對病原菌生長的影響

由表2可知，病原菌對pH值的適應范圍較寬，pH值為3～10時均可生長，pH值為4～6時生長速度較快，pH值為4時生長速度最快，此時菌落直徑達到4.58 cm，但菌絲較稀疏，pH值為5、6時生長速度次之，其菌落直徑分別為3.57、3.22 cm，且菌絲生長濃密，pH值呈堿性后菌絲生長速度變慢。

表2 不同pH值對菌絲生長的影響

2.3 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響

由表3可知，該菌在幾類不同碳源培養基上均能生長，最適合菌絲生長的碳源為果糖，菌落直徑達4.73 cm，菌落濃密，其次為蔗糖、麥芽糖，菌落直徑分別為4.02、3.81 cm，且菌落濃密。在無碳源的情況下，該菌仍能生長，且生長速度較快，菌落直徑達到4.43 cm，僅次于果糖，但其菌絲較稀疏。由表4可知，在不同氮源中，以蛋白胨為氮源時該菌生長得最好，菌落直徑達到5.57 cm，且菌落濃密，其次為牛肉膏，菌落直徑為5.02 cm，菌落濃密。在無氮源情況下該菌也可生長，菌落直徑為3.57 cm，但菌落較稀疏。以甘氨酸為氮源時會抑制該菌生長。

表3 不同碳源對菌落生長的影響

表4 不同氮源對菌落生長的影響

2.4 不同培養基對病原菌生長的影響

由表5可知，病原菌在幾種培養基中均能生長，該菌在PDA培養基上，菌落濃密，菌落直徑達5.37 cm，與其他培養基相比差異顯著(p＜0.05)，其次為胡蘿卜培養基、察氏培養基，菌落直徑分別為4.25、4.05 cm，但在察氏培養基上菌落較稀疏。該菌在水瓊脂培養基上生長較緩慢，直徑為2.27 cm，菌落較稀疏;在植物培養基上菌落直徑為3.38 cm，菌落較稀疏。

2.5 不同光照對病原菌生長的影響

由表6可知，病原菌在連續光照下生長速度最快，菌落直徑達到6.83 cm，與其他2種條件相比差異顯著(p＜0.05)，但菌落較稀疏，間斷光照與連續黑暗條件下的菌落直徑差異不顯著，菌落均較濃密。

2.6 菌絲、孢子的致死溫度

經試驗證實，病原菌菌絲的致死溫度為55℃，孢子的致死溫度為50℃。

表5 不同培養基對菌落生長的影響

表6 不同光照對菌落生長的影響

2.7 藥劑篩選試驗

對金刺梨黑斑病病原菌進行室內毒力測定，由表7、表8可知，幾種殺菌劑中80%多菌靈可濕性粉劑對該菌絲的抑制效果最好，EC50為0.56 mg/L;其次為75%百菌清可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，其 EC50分別為 2.51、4.61 mg/L;80%代森錳鋅可濕性粉劑與58%甲霜·福美雙可濕性粉劑對該菌菌絲的抑制效果較差，EC50分別為17.53、24.46 mg/L。

3 結論與討論

金刺梨黑斑病病原菌生長溫度較寬泛，在10～35℃均能生長，最佳生長溫度為28℃，此時生長速度快且菌絲濃密;該菌喜歡弱酸環境，當pH值為4時生長速度最快，但菌絲較稀疏;對碳源要求不嚴格，在無碳源、多糖、單糖的情況下均能生長，以果糖為碳源時生長最好;在幾種供試氮源中除甘氨酸不適合該菌生長外，其他幾種氮源或無氮源條件下該菌均能生長，以蛋白胨為氮源時生長最好;金刺梨黑斑病病原菌對營養條件要求不嚴格，在6種培養基上均能生長，最適培養基為PDA培養基;不同光照條件對該菌的生長速度有一定的影響，連續光照比其他2種光照條件生長快，但菌絲較稀疏;同時本研究的結果證實，該菌菌絲的致死溫度為55℃，孢子的致死溫度為50℃。

表7 不同藥劑對金刺梨黑斑病病原菌菌落生長的抑制效果

表8 不同殺菌劑對金刺梨黑斑病病原菌的毒力測定

目前，金刺梨黑斑病只是在局部區域發生，但危害較大，會直接導致金刺梨產量嚴重下降。本次試驗結果表明，80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對金刺梨黑斑病病原菌的抑制效果較好，58%甲霜·福美雙可濕性粉劑、80%代森錳鋅可濕性粉劑的效果較差，由于本研究只做了室內藥劑試驗，還未進行室外大田試驗，該結論有待進一步證實。