基于高通量測序的中華鳑鲏基因組微衛星特征分析及標記開發

熊良偉，王帥兵，封 琦，王建國，岳麗佳，張 娟，吳云菲，王 權

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300)

鳑鲏魚是一種常見的淡水小型鯉科魚類，在歐洲和亞洲地區分布廣泛，全世界鳑鲏魚有近40個種［1］。繁殖期時，雌鳑鲏魚利用生殖管突將卵產到背角無齒蚌(Anodonta woodiana)等淡水蚌的鰓中，同時雄鳑鲏將精子射到蚌體內，鳑鲏魚胚胎在蚌鰓瓣發育成熟后游出蚌體，由于其特殊的繁殖習性，一直以來，鳑鲏魚被當作共同進化研究理想材料［2－3］。而中華鳑鲏(Rhodeus sinensis)是我國特有鳑鲏魚類，是長江、珠江等支流水體中常見魚類之一，由于其資源豐富、色彩鮮艷、體型優美，還被用作觀賞魚類進行開發［4］。近年來，由于水體污染、水利設施建設，中華鳑鲏生存環境遭到破壞，中華鳑鲏野生種群數量不斷下降，一些水體中華鳑鲏正逐漸消失［5］，為此對中華鳑鲏的保護迫在眉睫。

利用分子標記技術分析水產動物遺傳多樣性可以為其資源保護和利用提供理論指導。微衛星(microsatellite)亦稱簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)，因其在基因組中分布廣泛、多態性豐富、PCR擴增重復性好和呈共顯性遺傳的優點，已廣泛應用于水生動物群體遺傳結構分析、遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種等研究［6－8］，成為當前常用分子標記之一。然而，每種生物的SSR標記在首次使用時須先進行分離和PCR擴增驗證，傳統通過構建富集文庫方法分離SSR標記須要經過建庫、雜交、分離、測序等步驟，試驗操作繁瑣、效率低［9］。利用高通量測序開發SSR標記具有操作簡單、效率高等特點［10－12］。本研究利用Illumina Miseq測序技術對中華鳑鲏基因組進行測序開發SSR標記，通過試驗驗證首次獲得中華鳑鲏21個多態性SSR標記，為中華鳑鲏遺傳種質資源保護和利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中華鳑鲏為筆者所在項目組2015年3—6月從泰州地區河道內收集經馴化中華鳑鲏。試驗時取活中華鳑鲏的背部和尾柄部肌肉置于100%乙醇中低溫保存，共采30尾。

1.2 基因組DNA提取與檢測

采用苯酚/三氯甲烷抽提和乙醇沉淀的方法分別提取中華鳑鲏基因組DNA，用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA完整性，用NanoDrop 2 000超微量分光光度計檢測DNA濃度和純度，要求 DNA 電泳主帶 21 kb，D260nm/D280nm在 1.80 ～2.00 nm，DNA樣品檢測符合要求后置于－80℃超低溫冰箱保存待用。

取1尾經檢測符合要求中華鳑鲏基因組DNA(約10μg)送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行基因組掃描。

1.3 基因組掃描與拼接

根據Illumina Miseq測序試驗流程構建1個350 bp Illumina Miseq PE文庫，利用MiSeq測序儀完成測序工作。利用生物信息統計學方法對原始測序數據(reads)進行質控。去除原始測序數據中的接頭(adapter)序列;去除原始測序數據的5'端含有非A、T、G、C堿基;修剪測序質量值＜Q20的原始測序數據末端;去除含N的比例達到10%的原始測序數據;舍棄質量修剪后長度＜25 bp的小片段，經過上述剪切獲得高質量的測序片段。

對剪切后的數據使用錯誤校正(ErrorCorrection)，去除低頻率的測序錯誤;后對校正后的數據進行連接(merge)，基于重疊(overlap)關系將剪切后的原始測序數據連接到一起;最后用專業組裝軟件GSde Novo Assembler v2.8對連接好的數據進行拼接獲得重疊群序列(Contigs)。

1.4 SSR 位點分析

利用 SSR位點查找軟件 MISA(MIcroSAtellite Identification Tool)在組裝的重疊群序列中查找SSR位點。參數設置:重復單元為1～6個堿基分別要求重復10、6、5、5、5、5次及以上。查找到的SSR序列記錄下重復序列單位(如AG、AAG)、重復次數和該位點重疊群序列號。

查找到的 SSR用 primer3(http://www.simgene.com/primer3)軟件設計SSR位點擴增引物，引物長度18～27 bp、GC含量50% ～80%，正反引物相差不超過20%，退火溫度(Tm)值控制57～63℃，正反引物Tm值相差不超過1℃，擴增片段大小為100～300 bp。

1.5 SSR PCR 驗證

從不同重疊群序列中選擇設計好引物的SSR位點50個，要求SSR重復單元為2個或2個以上核苷酸，SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。先用8個中華鳑鲏基因組DNA樣品進行 PCR擴增、PAGE電泳，檢測選擇SSR標記擴增效果;選擇擴增條帶清晰、多態性好的SSR標記檢測泰州地區中華鳑鲏遺傳多樣性。

PCR反應體積10μL，其中 DNA模板(約50 ng/μL)1μL，2×Tap PCR MasterMix(上海旭飛生物科技有限公司)5μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，去離子水 3 μL。PCR反應程序為:94℃ 預變性5 min;94℃變性40 s，退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR產物利用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，銀染法顯色、定影，照相機拍照保存［13］。

參考 DNA Marker標記(DL500 DNA marker，TaKaRa)，根據中華鳑鲏每個個體在檢測SSR位點電泳條帶的位置確定每個個體的基因型。利用CONVERT1.3.1軟件［14］將中華鳑鲏各位點基因型進行轉換。每個檢測SSR位點等位基因數(N)、觀測雜合度(HO)和期望雜合度(HE)由Popgene 1.32分析;用PICCale 0.6計算多態信息含量(PIC);哈迪－溫伯格平衡(Hardy－weinberg equilibrium，HWE)和連鎖不平衡情況由Popgene4.2檢驗。

2 結果與分析

2.1 基因組掃描與組裝

通過對中華鳑鲏350 bp Illumina Miseq PE文庫高通量測序獲得原始測序數據 151 418 131個 ×2條，堿基數45.43 Gb，對獲得原始測序數據每個位點堿基進行分析，結果獲得的reads序列第10位點后，各位點ATGC 4種堿基波動較小，幾乎呈一直線，N的比例非常低，說明建庫均勻，測序結果好，可用于后續分析。

通過對原始reads質量剪切，獲得高質量序列43.38 Gb。利用序列拼接軟件對剪切后數據進行組裝(表1)，共獲得重疊群序列 416 997個，片段累計長度5.17 Gb，GC含量為37.81%;組裝的重疊群序列中片段長段＞1 kb有203 411個，占48.78%;N50 和 N90 分別為1 852、1 139 bp，說明中華鳑鲏基因組組裝質量好。

表1 中華鳑鲏基因組組裝情況一覽表

2.2 SSR 位點分析

從組裝的序列中共檢測到249 167個SSR位點，其中二核苷酸重復 SSR最多，有 133 528個，占總 SSR數量的53.59%;其次為單核苷酸重復SSR，有85 198個;其他數量由多到少依次為三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復SSR，分別為 17 652、11 436、1 124、229 個(表 2)。隨著重復單元重復次數增加，SSR數量逐漸減少(圖1)。

表2 中華鳑鲏基因組中不同類型SSR統計

由表2可知，二核苷酸重復SSR占總SSR數量達到53.59%，說明二核苷酸重復SSR是中華鳑鲏主要SSR類型。在SSR分析過程中，考慮到堿基互補配對，將同類重復兼并為一種重復，二核苷酸重復SSR有AC/CA/TG/GT、AG/GA/TC/CT、AT/TA、GC/CG 4種重復類型。由圖2可知，二核苷酸重復SSR 4種類型重復SSR數量相差較大，重復序列為AC/CA/TG/GT SSR有80 964個，比例達到60.63%;重復類型為GC/CG SSR僅有423個，比例僅為0.32%;重復類型為AG/GA/TC/CT和 AT/TA的 SSR數量較為接近，分別有29 587 個(22.16%)和 22 554 個(16.89%)。

2.3 中華鳑鲏SSR評價

在查找的SSR位點中有212 109個位點設計出符合條件的PCR引物，占總位點數的85.13%。隨機合成的50對PCR引物擴增驗證結果中有9對引物未能檢測出擴增產物;41對引物檢測出擴增產物，其中，在8份DNA樣品中擴增產物帶型復雜或無多態性的引物有13對，其余28對引物擴增產物帶型清晰、無(或少量)雜帶、具多態性。

2.4 中華鳑鲏群體遺傳多樣性分析

采用“2.3”中多態性豐富、擴增條帶清晰的28對SSR引物檢測分析中華鳑鲏泰州野生群體遺傳多樣性，28對引物中有21對引物擴增效果穩定、產物帶型清楚，其SSR特征見表3。21個SSR位點中每個位點觀測到等位基因3～13個;觀測雜合度和期望雜合度分別為 0.306 7～0.914 5和0.384 5 ～0.952 1;多態性信息含量為 0.317 3 ～0.910 5;分析得到 Rs4、Rs9和 Rs36 3個位點存在無效等位基因;經Bonferroni校正后，除 Rs4、Rs43、Rs44 3個位點外，其余位點等位基因頻率符合Hardy－Weinberg平衡;連鎖不平衡檢測表明，各位點間不存在連鎖不平衡現象。

3 討論與結論

SSR是由1～6個核苷酸為重復單元組成的DNA序列，在真核生物基因組中廣泛存在［15］，有了生物基因組信息就可以分析基因組SSR特征。隨著基因組學研究技術進步，世界上許多重要經濟魚類基因組序列圖譜已經繪制。我國鯉科魚類資源豐富，2014年和2015年我國研究人員先后完成了鯉魚(Cyprinuscarpio)［16］和草魚(Ctenopharyngodon idellus)［17］基因組測序工作，其中鯉魚基因組為16.9 Gb，雌草魚基因組0.9 Gb、雄草魚1.07 Gb。2016年Yang等完成了滇池金線鲃(S.grahami)、犀角金線鲃(S.rhinocerous)和安水金線鲃(S.anshuiensis)基因組序列研究工作，獲得3種金線鲃基因組序列分別為 1.75、1.73、1.68 Gb［18］。本試驗利用 Illumina Miseq測序技術對中華鳑鲏基因組進行掃描，獲得高質量基因組序列43.38 Gb，組裝后的contigs序列長度達到5.17 Gb。參考草魚、金線鲃和鯉魚基因組大小，本次中華鳑鲏基因組測序深度大，基因組覆蓋率高，組裝后的contigs序列特征能代表基因組特征，因此本次開發的微衛星標記能反映中華鳑鲏基因組SSR標記特征。

從查找到中華鳑鲏SSR位點來看，中華鳑鲏SSR種類較豐富，基因組中1～6核苷酸的重復SSR均存在，其中二核苷酸重復SSR占主導地位，占SSR總數的53.59%，其次是單核苷酸重復SSR，占SSR總數的34.19%，而3～6核苷酸重復SSR含量較低，均不超過8.00%。進一步分析發現，二核苷酸重復的4種類型SSR標記數量相差較大，AC/CA/TG/GT重復序列SSR占二核苷酸標記60.63%，GC/CG重復序列僅占0.32%，AG/GA/TC/CT和 AT/TA重復序列SSR分別占22.16%和16.89%。說明在中華鳑鲏基因組中以二核苷酸重復SSR標記為主，AC/CA/TG/GT重復序列SSR數量豐富，而GC/CG重復序列SSR少見。在裸體異鰾鰍(Xenophysogobio nudicorpa)SSR特征分析中發現，二堿基重復SSR占總SSR比例高達83.15%，AC/CA/TG/GT重復占二堿基重復SSR 49.36%，僅發現4個核心序列為GC/CG的重復類型［11］;中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)基因組掃描分析結果表明，二堿基重復SSR占總SSR比例最高，達到58.54%，二堿基重復 SSR中 AC/CA/TG/GT重復類型為 67.55%，GC/CG 重復類型不到0.01%［10］。裸體異鰾鰍和中華絨螯蟹SSR特征與中華鳑鲏SSR特征相似，說明AC/CA/TG/GT重復SSR在水產動物基因組中分布較多，GC/CG重復SSR較少。

在高通量測序技術廣泛應用之前，富集法成為開發SSR標記最常用的方法。魯翠云等采用磁珠富集法結合放射性同位素雜交法得到 SSR序列 325個，合成引物 145對，有44.62%SSR位點可以設計引物［19］;郭寶英等采用生物素標記的(CA)12探針從黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)基因組富集庫中篩選SSR標記，結果124個含SSR序列中有59條可以設計引物，比例為47.58%［20］。本研究利用 Illumina Miseq測序技術開發中華鳑鲏SSR標記，從基因組中查找到各種類型重復 SSR位點249 167個，由于組裝序列長，85.13%SSR位點可以設計出引物，PCR擴增試驗中合成的50對引物中僅9對引物未能得到擴增產物。由此可以看出，利用高通量測序技術開發SSR標記不僅數量大，而且拼接后序列長，可設計PCR引物的SSR位點比例高。

表3 中華鳑鲏21個多態性微衛星位點的基本信息和遺傳多親性參數

21個多態性SSR檢測泰州地區中華鳑鲏群體結果顯示，每個SSR位點存在等位基因3～13個，平均7個，PIC平均值超過0.500 0，達到0.655 3，絕大多數標記(21個標記中的18個)符合Hardy－Weinberg平衡，且各位點間不存在連鎖不平衡現象。上述結果表明，本研究開發21個多態性SSR標記適用于我國中華鳑鲏野生資源評估和遺傳多樣性分析。