基因組重排技術在微生物育種中的應用研究進展

趙麗紅，陳 威，高艷嬌，肖 靜

(遼寧工業大學土木建筑工程學院，遼寧錦州121001)

微生物資源具有可再生性，其開發利用具有廣闊的前景。選育具有優良性狀、高產等性能的優良菌株，是開發利用微生物資源的首要任務。然而野生菌株一般很難達到工業生產的要求，所以就需要一定的育種方法對野生菌株進行改良，以得到具有所需優良性狀的菌株。目前傳統育種技術操作簡單，也比較成熟，但是獲得目的性狀菌株的過程復雜、耗時長、工作量巨大、效率低、盲目性高?，F代分子生物學手段雖然取得了一定的發展，但是須要對微生物進行定向的基因操作，技術要求十分高，欠缺基因型和表型相應的背景，不利于廣泛推廣?；蚪M重排技術在這樣的背景下應運而生。Zhang等在2002年首次提出基因組重排技術，其基本原理是基于原生質體融合技術將多個親本的全DNA基因組進行重組，從而快速得到具有融合各親本優良性狀的子代。他們成功將該技術用于提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力，并取得了顯著成果，使弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力得到極大提高［1］。

基因組重排技術是一種在分子定向進化基礎上發展而來的新型分子育種技術，它將重組的對象從單個基因擴展到整個基因組，從雙親本擴展到多親本，從一輪原生質體融合擴展到多輪原生質體融合，因此可以對菌株的目的性狀進行更快以及更大范圍的優化組合［2］。

1 基因組重排的方法與原理

基因組重排技術主要由構建親本庫、原生質體遞歸融合、目的表型的篩選3個過程組成。每個過程都有自己的特點和一定的技術手段。Gong等給出了基因組重排技術的操作流程［3］，如圖1 所示。

1.1 構建親本庫(parental library)

基因組重排技術的初始菌株應該包含更多的基因型，收集相關菌株以形成親本庫，能為后面的原生質體融合提供可靠的基礎。初始菌株的種群多樣性和菌株豐富的表型是進行基因組重排技術的第1步。

目前構建親本庫的主要方法還是經典的方法如突變和直接篩選等，其中突變是獲得豐富基因型的主要方法，在這個過程中，須要使用化學誘變劑或者物理誘變方式對原始菌株進行誘變處理。如劉源慧分別利用紫外誘變和微波誘變方法對米曲霉(Aspergillus oryzae)FS－16進行誘變，從得到的誘變菌株中選取α－淀粉酶產量較高的突變株與原始菌株FS－16作為親本，然后進行基因組重排，最后得到α－淀粉酶酶活較高的子代菌株［4］。

構建親本庫時，為了獲得豐富的基因型主要是采用組合的方式。篩選菌株的主要方法根據目的表型，比如產量和環境耐受性等。可是菌株的生長性狀也應該被給予足夠的重視，因為擁有較高產量和環境耐受性菌株的生長性狀可能會受到損害。因此，構建親本庫時應采集野生菌株，以促進復雜子代的生長特性。其次，通過合理的方式獲得的菌株也可以作為基因組重排的出發菌株。應用合理的篩選方法可以擴大親本菌株的篩選范圍，從而能增大經過基因組重排技術處理后獲得目的表型的概率。

1.2 原生質體的遞歸融合(recursive protoplast fusion)

基因組重排是基于原生質體融合技術(protoplast fusion)的育種技術。原生質體的多輪遞歸融合使細胞之間的基因轉移頻率大大增加。在原生質體的遞歸融合過程中，來自親本的原生質體經歷混合(mix)、融合(fusion)、再生(regeneration)等過程。然后從再生的原生質體中選出性狀優良的菌株，作為下一輪原生質體融合的出發菌株。同時親本菌株基因的多樣性在原生質體遞歸融合的操作下能夠被擴充到子代中，這樣有利于得到目的表型。

經典的基因組重排技術主要依賴于PEG(聚乙二醇)誘導原生質體融合，但PEG誘導存在效率低、重組菌不穩定、易退化、須制備雙親本原生質體等缺點，這極大阻礙了基因組重排技術在微生物中的育種應用。目前，使用化學藥劑和電脈沖法誘導原生質體融合是主要的方法。Skelley等在細胞融合前利用微流體裝置對細胞進行排列，這很大程度上提高了原生質體融合的效率［5］，同時原生質體的再生率也是基因組重排取得成功的關鍵。Imada等研究表明，原生質體的再生率在液體再生培養基中優于固體平板［6］。

1.3 目的表型的篩選(selectionofdesiredphenotype)

確?；蚪M重排技術成功的重要步驟是目的表型的篩選。盡管可以在特定的培養基上培養子代以獲得特定的抗性菌株，但是過量代謝產物的產生一直以來都被認為是進行表型篩選的難點。傳統篩選改良菌株的方式取決于菌株的生理生化特性，如在瓊脂平板上的水解圈、透明圈和抑菌圈等。John等利用乳酸融合菌能夠直接水解淀粉這一特性，根據乳酸融合菌水解淀粉產生的透明圈的大小篩選出了高產乳酸融合菌［7］。另外，利用遺傳標記的方法也可以篩選融合菌株。Dai等利用菌體營養缺陷型的遺傳標記成功標記了革蘭氏陰性細菌的目的融合子［8］。

通過滅活原生質體篩選融合子的方法也有一定應用，原生質體通過加熱或紫外線照射最終達到滅活的目的。理論上，一種特定的滅活方式可能在染色體的同一位點帶來損害，如果幾個親本原生質體采用同樣的方法滅活，將會給融合子再生帶來困難;但是染色體上不同位點的損傷卻可以得到互補修復，所以一般需要采用不同滅活方式提高融合子再生率。Kang等分別采用紫外線和熱滅活的方式處理親本原生質體，最終篩選出理想的表型融合子［9］。近年來，高通量的篩選方法得到了很快發展，如熒光激活細胞分選技術、液相色譜質譜法等，這些新技術使融合子的篩選效率得到了顯著提高。

2 基因組重排技術的優勢

傳統育種方法曾發揮著很大的作用，但缺點是工程量巨大、耗時長且難以獲取復雜表型［10－12］。作為新興的育種技術，基因組重排在微生物育種方面擁有許多傳統育種技術所無法比擬的優勢。

2.1 基因組重排技術是多親本基因水平上的轉移

基因組重排技術能夠實現多親本基因水平上的轉移。利用原生質體融合技術的優點，以實現多親本、遠源親本間的基因組轉移、重排，很大程度上增加了多重優良性狀在子代出現的概率。如Yamashita等通過灰色鏈霉菌和天神島鏈霉菌種間基因組重排，篩選到1株重組子菌株，此菌株可產生抗生素吲哚佐霉素(indolizomycin)［13］。王航等將篩選到的鏈霉素抗性菌株(Str－70)與慶大霉素抗性菌株(Gen－139)作為出發菌株進行多輪基因組重排，最終得到的菌株(SG4－34)同時具有2種抗性且多殺菌素產量與原始菌株相比提高6倍［14］。

2.2 基因組重排技術避免菌株產生“疲勞效應”

傳統誘變育種技術由于長期使用誘變劑，菌株自身抗性會得到增強，最終造成菌株產生“疲勞效應”?；蚪M重排是利用原生質體遞歸融合技術來改良的菌株，整個過程只有1次誘變，所以避免產生“疲勞效應”等現象。

2.3 基因組重排技術快速高效

傳統誘變育種是對單一原始菌株用傳統的誘變方法進行誘變，以得到有利的突變性狀，過程繁瑣、時間漫長且存在較大的盲目性?；蚪M重排技術獲得正突變菌株只須1次誘變，然后利用原生質體遞推式融合技術改良菌株，這個過程涉及多親本全基因組范圍的遺傳信息交換，獲得正突變性狀的速度大大提高，同時也更加高效。如Zhang等發現，對菌株進行2輪基因組重排所達到的成果，相當于傳統誘變育種需要20 年才能完成［1］。

2.4 基因組重排技術簡化了育種過程

通過定向進化工程、DNA重組技術、生物學和代謝工程手段等，雖然也可以獲得理想的優良性狀，從而實現定向進化，但是這些技術須要巨大的人力物力去了解目標菌株的遺傳背景與規律?；蚪M重排技術的對象是親本的全基因組，進行隨機交換重組，并篩選出帶有目的性狀的優良菌株，這個過程不用了解微生物的遺傳背景，省去了大量繁重的工作，極大地提高了育種速率與效率。

3 基因組重排技術的應用

基因組重排技術經過十幾年的發展充分融合了細胞工程和誘變育種的特點，在微生物育種以及獲得代謝產物等方面體現出了很明顯的優勢。而且基因組重排技術在提高菌株代謝產物產率、增強菌株耐受性、提高底物利用率和范圍以及改造微生物的代謝途徑等方面均取得了較大的發展。

3.1 提高產物產率

基因組重排技術可以快速得到帶有目的表型的菌株，同時可以有效地優化、調節多基因控制的性狀，以提高菌株的產量。目前，在提高代謝產物產率方面已經有了許多成功的應用。

El－Gendy等以諾卡氏菌阿萊2000菌株為原始菌株，通過基因組重排技術篩選出綾霉素產量很高的目的菌株。首先通過傳統的誘變技術在原始菌株的基礎上得到改良菌株，在改良菌株的基礎上又進行基因組重排，并以綾霉素產量作為篩選指標，通過3輪基因組重排后最終得到目的菌株，目的菌株的綾霉素產量是原始菌株的19倍，是改良菌株的1.9倍［15］。Zheng等利用濃縮的高效液相色譜法篩選出產生丁二酸濃度較高的菌株，然后將所篩選的菌株作為初始菌株，經過3輪基因組重排，得到子代菌株丁二酸的產量比親本菌株提高約73%［16］。Chalopagorn等利用基因組重排技術提高嗜熱芽孢桿菌屬的脂肪酶產量，將芽孢桿菌屬CF03菌株經過紫外線照射和甲磺酸乙酯(EMS)誘變，以所獲得的誘變菌株為初始菌株，經過2輪基因組重排，得到融合菌株(FB1)，與野生型菌株相比，FB1菌株的生長率和脂肪酶的產量最高分別增加了150%和238%［17］。表1總結了基因組重排技術在提高產物產率方面的應用。

表1 基因組重排技術在提高產物產率方面的應用

3.2 增強菌株對環境的耐受性

目前，基因組重排技術在增強菌株對酸、鹽、產物、底物、溶解氧、副產物及溫度等因素的耐受性方面已有很多成功的應用。Patnaik等利用基因組重排技術篩選出了耐酸性更強的乳酸菌菌株［30］。Dai等利用基因組重組技術成功得到了能耐受8 mmol/L五氯苯酚(PCP)的融合子，并且此融合子能夠在48 h內完全降解3 mmol/L PCP［31］。2008年王立梅等利用基因組重組技術得到了能夠在pH值為3.6的環境下生長且L－乳酸產量達到5.67 g/L，發酵溫度達到40℃的菌株［32］。Cao等以異常漢遜酵母菌株作為原始菌株，通過3輪基因組重排得到目的菌株，其具有很高的耐鹽性能和pH值生長范圍［33］。Zheng等以來自原始菌株釀酒酵母的紫外線突變體為出發菌株，經過2輪基因組重排得到重組菌株YZ2，此重組菌株在乙酸壓力下顯示出更快生長速度和細胞生存能力［34］。Zheng等在谷氨酸棒狀桿菌原始菌株的基礎上經過紫外線照射和耐高溫等傳統誘變技術手段篩選出5株菌株，將此5株菌株又通過3輪基因組重排技術得到1株目的菌株，經過試驗與分析，目的菌株的L－谷氨酸的產量比原始菌株產量提高了1.8倍，耐熱性也得到了一定的提高［35］。黃俊等采用基因組重排技術有效而快速地獲得了在產乙醇能力和乙醇耐受力方面都更好的里氏木霉菌株［36］。Li等通過連續4輪基因組重排，獲得丙酮丁醇梭菌的融合菌株，融合菌株在耐熱性、溶劑耐受性及環境穩定性方面比野生菌均有進一步提高［37］。

3.3 提高底物利用率及其范圍

微生物對底物的利用率和范圍是菌株非常重要的目的表型，基因組重排技術在提高微生物底物利用率及范圍方面也有著重要的成果。如John等以德氏乳酸桿菌和產淀粉酶的枯草芽孢桿菌為親本菌株，利用基因組重排技術，篩選到了能直接轉化淀粉為乳酸的子代菌株［7］。Zhao等將輪枝霉(Diasporangium sp.)和黑曲霉作為親本菌株，利用基因組重排技術得到的新菌株可以利用全部8種碳源，而親本僅僅能利用 4種碳源［38］。Kang等把出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)N3.387作為基因組重排的出發菌株，通過基因組重排后獲得融合菌株F3－2，相比于野生菌株，融合菌株對底物的利用率提高了29.0%［39］。Zhou等利用基因組重排技術，從鏈霉菌中篩選出不僅ε－聚賴氨酸產量高，且對產物ε－聚賴氨酸具有一定抗性的融合菌株［40］。

3.4 改造微生物的代謝途徑

在基因組重排技術中隨著整個基因組片段的重排，可以使細胞表型得到快速改進，細胞的代謝途徑也可以得到一定的優化。基因組重排能夠激活菌株內部某些沉默基因而獲得新的代謝產物。如Wang等在利用基因組重排技術提高瘤座霉屬(Tubercularia sp.TF5)菌株的紫杉醇產量試驗中，在子代融合子的代謝產物中發現了8種新結構的物質。這些物質與直接親本和原始菌株所產的同類物質結構均不同，這說明子代融合子所產生的新物質是基因組重排后某些沉默基因被激活 表 達 造 成 的［41］。Cao 等 對 魯 氏 接 合 酵 母(Zygosaccharomyces rouxii)進行3輪基因組重排后獲得1株融合菌株，其能產生親本菌株無法產生的新的化合物［42］。

4 展望

基因組重排技術的研究對象為微生物細胞內整套基因組，不須要探究菌株的遺傳背景，利用多輪循環式基因組重排篩選，將多個優良性狀集中到子代目的菌株中，這是傳統育種技術、原生質體融合技術和DNA重排技術所不具有的獨特優勢，是微生物育種技術中的具有里程碑式意義的進步。正突變基因庫的建立是基因組重排技術中關鍵一步，其多樣性以及與目的性狀的相關性直接關系到重排能否成功，所以正突變基因庫的構建方面還需要更多的探索。傳統的化學融合、電融合等融合效率較低，新興的融合技術如微流體技術、激光誘導技術等雖然融合效率較高，但是使用范圍較窄，所以可能還須要進一步探索新的原生質體融合技術。在融合子的篩選方面，目前常用的方式是熱滅活與紫外滅活標記，這2種方式會對原生質體帶來一定的生理損傷，影響融合效率，因此還須要高通量的篩選方法來保證基因重排技術的進一步發展。目前，盡管基因組重排技術在克服不同親本細胞重組成功率較低問題，以及高效篩選融合菌株等方面還存在一定程度的挑戰，但是隨著基因組重排技術與其他生物技術如代謝工程、基因組學等相結合以及多種高通量、高效率篩選策略的出現，基因組重排技術將會有更快的發展和更廣闊的應用。