毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光法分離檢測麥芽中大麥芽堿

周 桂，謝貽冬，羅珍連，李美蘭，賁蓓蓓，鄧光輝

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530006)

麥芽是1年生禾本科(Gramineae)植物大麥(Hordeum vulgare)的成熟果實(shí)經(jīng)過干燥的炮制加工成品。將麥芽用于醫(yī)藥最早記載于南朝梁陶弘景的《別醫(yī)名錄》:“以作糵，溫，消食和中”，至今已有1 000多年的歷史［1］。唐朝蘇敬的《新修本草》和明朝李時(shí)珍的《本草綱目》等古醫(yī)書籍以及現(xiàn)代的《中國藥典》中也記載了麥芽的相關(guān)藥用功效，認(rèn)為麥芽具有治療脾虛、消脹、退乳等作用［2－5］。麥芽中所含的大麥芽堿(hordenine)化學(xué)名為4－(2－二甲胺基乙基)苯酚，具有收縮血管、興奮中樞神經(jīng)、松弛支氣管平滑肌等作用［6－7］。隨著對(duì)大麥芽堿研究的深入，其分析檢測的方法主要有高效液相色譜法、薄層層析法、雙電極液相色譜庫侖檢測、高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用等［8－11］。目前還未見到有關(guān)毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光(CE－ECL)法分離檢測大麥芽堿的報(bào)道。

毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光法是20世紀(jì)80年代開始發(fā)展起來的分離技術(shù)［12－16］，具有選擇性高、效率高、分析速度快和易操作等優(yōu)點(diǎn)［17－20］，因此在生物堿等化學(xué)物質(zhì)的檢測方面越來越受到重視［21－25］。本研究基于大麥芽堿能夠增強(qiáng)Ru(電化學(xué)發(fā)光性號(hào)的特性，建立一種測定大麥芽堿的毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光新方法，并應(yīng)用于麥芽中大麥芽堿的分離檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

麥芽由廣西南寧市中藥材市場提供，大麥芽堿標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%)由北京索萊寶生物科技有限公司提供，并于筆者所在實(shí)驗(yàn)室－20℃冰箱保存。

磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉均為分析純，由北京索萊寶生物科技有限公司提供。三聯(lián)吡啶釕［Ru(bpy)3Cl2·H2O≥98%］，由梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

MPI－A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀(陜西西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司);三電極體系由自制的碳纖維簇微盤電極(工作電極)、飽和甘汞電極(參比電極)、鉑絲電極(輔助電極)組成;未涂層石英毛細(xì)管(50μm×50 cm，河北永年光導(dǎo)纖維廠);JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(浙江寧波新芝生物科技股份有限公司);BSA124S－CW電子天平(Sartorius科學(xué)儀器北京有限公司);1810－B型自動(dòng)雙重水蒸餾器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的制備 精確稱量大麥芽堿0.10 g，用無水乙醇溶解并定容100 mL，在4℃條件下避光存放于棕色試劑瓶中，用時(shí)適當(dāng)稀釋。

將麥芽研磨成粉，并過60目篩后準(zhǔn)確稱取2.00 g于50 mL的具塞錐形瓶中，加入20 mL無水乙醇，100 W超聲破碎處理30 min后浸提24 h，12 000 r/min離心25 min，取上清液。

1.3.2 毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光檢測條件 在每次使用前，毛細(xì)管先分別用0.1 mol/L NaOH溶液和二次蒸餾水沖洗10 min，再用運(yùn)行緩沖液沖洗20 min。鉑電極用0.05μm的Al2O3粉末拋光平整并超聲清洗干凈，在顯微鏡下與毛細(xì)管對(duì)接。在ECL池中加入5 mmol/L Ru(bpy)32+和60 mmol/L PBS緩沖液(pH值 8.0)350μL，電泳分離緩沖液為10 mmol/L PBS(pH值6.15)。毛細(xì)管分離電壓為13 kV，進(jìn)樣電壓10 kV，光電倍增管高壓800 V，進(jìn)樣時(shí)間10 s，以電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的峰高定量。為了獲得良好的重現(xiàn)性，減小由于溶劑蒸發(fā)等因素的影響，每3 h更換1次Ru(bpy)32+。所有進(jìn)樣溶液在進(jìn)入毛細(xì)管前須用0.22μm微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測電位的影響 工作電極上的檢測電位是影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的一個(gè)重要因素。控制其他條件不變，大麥芽堿的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著電極電位從1.00～1.20 V的變化而變化(圖 1)。在 1.00～1.16 V范圍內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)強(qiáng)度隨著電極電位的增加而不斷增加，當(dāng)電極電位達(dá)到1.16 V時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大。當(dāng)電極電位超過1.16 V時(shí)，ECL強(qiáng)度隨著電極電位的增加而下降，所以選擇1.16 V為大麥芽堿的電化學(xué)發(fā)光最佳檢測電位。

2.1.2 檢測池中PBS濃度和pH值的影響 檢測池PBS的濃度和pH值也是影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的重要因素。控制PBS的pH值固定不變，檢測其濃度30～70 mmol/L時(shí)，大麥芽堿電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化。結(jié)果(圖2)表明，PBS濃度在30～60 mmol/L時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著PBS濃度的增大而增大，當(dāng)PBS濃度超過60 mmol/L時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著PBS濃度的增大反而減小，所以選60 mmol/L為PBS的最佳濃度。控制PBS的濃度為60 mmol/L不變，檢測pH值在6.5～9.0范圍內(nèi)變化時(shí)，大麥芽堿電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化。結(jié)果(圖3)表明，在pH值6.5～8.0范圍內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著pH值的增大而增大，當(dāng)pH值超過8.0時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著pH值的增大而而減小，所以選擇8.0為最佳pH值。

2.2 分離條件的優(yōu)化

2.2.1 分離緩沖液的pH值和濃度的影響 分離緩沖液中的pH值會(huì)通過影響點(diǎn)滲流和樣品的分離效率，從而影響樣品的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。控制分離緩沖液的濃度不變，檢測pH值從5.5變化到8.5過程中電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化。結(jié)果(圖5)表明，pH值在5.5～6.5之間時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著pH值的升高而升高，并在pH值為6.5時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)pH值超過6.5時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱，因此選擇pH值6.5的緩沖液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)，分離緩沖液的濃度也是影響電化學(xué)發(fā)光的一個(gè)因素。控制緩沖液的pH值為6.5不變，檢測緩沖液濃度為5～30 mmol/L時(shí)的樣品電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果(圖6)表明，當(dāng)濃度為5～10 mmol/L時(shí)，ECL發(fā)光強(qiáng)度隨緩沖液濃度的增加而增加，當(dāng)緩沖液濃度超過10 mmol/L時(shí)，ECL發(fā)光強(qiáng)度開始下降，所以選擇運(yùn)行緩沖液濃度為10 mmol/L最佳。

2.2.2 分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的影響 分離電壓主要影響樣品的遷移時(shí)間，分離電壓越高，遷移時(shí)間越短。當(dāng)分離電壓在8～18 kV范圍內(nèi)變化時(shí)，綜合考慮靈敏度、峰寬、噪音、分析時(shí)間及焦耳熱等因素，選擇13 kV作為分離電壓較為合適。大麥芽堿采用電動(dòng)進(jìn)樣，選擇進(jìn)樣電壓為12 kV，檢測不同的進(jìn)樣時(shí)間對(duì)ECL發(fā)光強(qiáng)度、遷移時(shí)間和峰寬等的影響。在5～10 s的進(jìn)樣時(shí)間范圍內(nèi)，ECL發(fā)光強(qiáng)度隨進(jìn)樣時(shí)間的增加而增加，但當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過10 s時(shí)，ECL發(fā)光強(qiáng)度基本不變，且峰變寬，所以考慮到進(jìn)樣時(shí)間對(duì)峰型的影響，選擇10 s為最佳進(jìn)樣時(shí)間(圖7)。

2.3 檢出限、精密度和線性范圍

配制一系列濃度的大麥芽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在已優(yōu)化的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測5次，以ECL發(fā)光強(qiáng)度(I)對(duì)大麥芽堿標(biāo)準(zhǔn)品含量(c，μg/L)繪制工作曲線，得到線性方程為 I=0.257 6c－ 429.81(r2=0.998 9)，線性范圍為5 000.00 ～ 100 000.0 0 μg/L，檢 出 限 (S/N=3) 為60.00μg/L。在此最優(yōu)條件下對(duì)10 000.00μg/L麥芽堿進(jìn)行5次分離檢測，得到大麥芽堿的遷移時(shí)間和ECL發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為1.48%、2.69%，說明該方法的精密度良好。大麥芽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的毛細(xì)管電泳圖見圖8。

2.4 樣品檢測及回收率

圖9為麥芽樣品的CE－ECL發(fā)光圖，測得麥芽中大麥芽堿的含量為(0.239±0.021)mg/g。樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表1，電泳條件為:分離電壓13 kV，分離緩沖液濃度10 mmol/L，pH 值 6.5，進(jìn)樣時(shí)間 10 s，檢測電位 1.16 V，檢測池 PBS 濃度 60 mmol/L，pH 值 8.0，Ru濃度5 mmol/L，加標(biāo)的回收率在93.71% ～104.31%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差≤3.29%。

表1 麥芽中18 230μg/L麥芽堿加標(biāo)回收率測定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

采用毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光檢測法分離并檢測了麥芽中的大麥芽堿，得到最佳分離檢測條件:分離電壓13 kV，分離緩沖液濃度10 mmol/L，pH值 6.5，進(jìn)樣時(shí)間10 s，檢測電為 1.16 V，檢測池 PBS 濃度 60 mmol/L，pH 值 8.0，Ru濃度5 mmol/L。在此最優(yōu)條件下檢測到大麥芽堿的含量檢測限(S/N=3)為60.00μg/L，麥芽中大麥芽堿的含量為(0.239 ±0.021)mg/g。加標(biāo)回收率為 93.71% ～104.31%。相比較于高效液相色譜法和分光光度法，此方法具有操作簡單、檢測速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢出限低、少干擾、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可為麥芽中大麥芽堿的檢測鑒定提供依據(jù)，有望應(yīng)用于麥芽或其他植物中的大麥芽堿含量檢測和分析鑒定。