二甲雙胍對肝癌細胞HepG2中人類白細胞抗原-Ⅰ類分子表達的影響

胡臘 馮笑 陳紀濤 劉兆宇 翁錦生 李曉媚 曾子成 劉季芳

廣州醫科大學附屬第五醫院（廣州 510700）

人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）幾乎在所有有核細胞中表達，主要在細胞間相互識別、抗原提呈及免疫應答中具有重要作用。HLA?I除了參與腫瘤細胞的免疫監視及免疫逃避外，對由T細胞介導的腫瘤治療也有嚴重影響[1]。有文獻報道[2]HLA?I在人體多種腫瘤組織中均表達降低，促進癌細胞逃避T細胞介導的免疫監視；此外HLA?I表達降低會抑制細胞毒性免疫機制的激活，進而影響以T細胞活化為基礎的腫瘤治療效果[3]。

流行病學研究表明，二甲雙胍能夠降低2型糖尿病患者患癌癥的風險[4]。在非免疫缺陷型的白血病老鼠模型中，二甲雙胍能夠增加CD8+腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）的數量，并保護細胞免于衰竭和凋亡，進而發揮其免疫介導的抗腫瘤效應[5]。此外，二甲雙胍可通過激活AMPK途徑而殺死結腸癌[6]、骨髓瘤和乳腺癌的癌細胞。

研究發現，二甲雙胍可通過改變乳腺癌細胞的能量代謝，增加乳腺癌細胞表面HLA?I的水平，進而降低腫瘤細胞逃避機體免疫監視的能力[7]。那么，二甲雙胍是否可通過影響肝癌細胞中HLA?I及其亞型的表達進而發揮其免疫介導的抗肝癌效應？目前尚未有相關文獻報道，因此本文就這一科學問題展開研究，主要通過觀察不同濃度的二甲雙胍對肝癌細胞中HLA?I類分子（HLA?E、HLA?A2402和β2?M）的影響，初步探討二甲雙胍抗肝癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院細胞庫，細胞使用RPMI1640培養基（內含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2培養箱中常規培養。

1.1.2 試劑二甲雙胍購自德國Sigma?Aldrich；Human HLA class I PE?conjugated Antibody購買自R&D Systems公司；磁珠購自BD公司；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、RT?PCR試劑盒購自Takara；RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清及PBS購自美國Glibco公司。

1.1.3 主要儀器流式細胞儀（BD FACSCantoⅡTM）；實時熒光定量PCR儀（ABI7500）；雙模塊PCR儀（伯樂S100048/48雙模）；多功能酶標儀（美國BioTEK）；倒置熒光顯微鏡（萊卡DMi8）；恒溫水浴鍋（德國Thermo Scientific）；水平層流超凈工作臺（德國Thermo Scientific Hohen）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將培養基、血清、胰酶、PBS、培養皿等物品放入超凈臺中并打開紫外燈滅菌30 min；預先打開水浴鍋開關并設置溫度為37℃，待水浴鍋溫度升至37℃后將細胞從液氮罐中取出后迅速在水浴鍋中不斷搖晃至凍存液完全融化，然后將其轉移至加有8 mL培養基（RPMI 1640+10%FBS）的培養皿中，并吹打混勻，然后將細胞置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕箱中培養，定時對細胞進行換液和傳代。

1.2.2 藥物處理取對數生長期的HepG2細胞，用PBS洗滌細胞兩遍，用0.25%的胰酶充分消化細胞后，用含血清的培養基終止消化并吹打混勻后均勻接種于兩塊六孔板中，放入37℃、5%CO2的恒濕箱中培養過夜，次日上午對照組中加入0 mmol/L二甲雙胍的不含胎牛血清的RPMI 1640培養基，實驗組中分別加入含0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍的無血清的RPMI1640培養基，同時另外兩孔中加入25、50 ng/mL的干擾素（interferon，IFNγ）作為陽性對照，將處理后的細胞放入培養箱中培養24 h后根據實驗需要做相應處理。

1.2.3 流式樣本制備（1）細胞準備：①取預先處理好的對數生長期的六孔板細胞，用PBS洗兩次后每孔加入100 μL胰酶進行消化；②待消化充分后加入2 mL培養基終止消化并吹散混勻，將吹散好的細胞轉移到15 mL離心管中做好標記并離心（300 g/5 min）；③棄去上清，加入一定量PBS洗滌后離心（300 g/5 min），再棄去上清，加入0.5 mL PBS后將細胞輕輕混勻。（2）染色上機：①從上述離心管中各取50 μL的細胞于相應流式管中并標注為處理組，向各流式管中加入對應的熒光素標記抗體HLA?ABC抗體（每種5 μL（抗體及細胞比例為1∶10）后混勻），室溫避光孵育25 min（孵育過程中再混勻一次）；②從上述離心管中各取50 μL的細胞于相應流式管中并標注為對照組，對照組不加染料（抗體）；③除了上述兩大組（處理組和對照組）樣本外，尚有2管用來調補償的樣本：細胞量同上50 μL，向其中一管加入HLA?ABC抗體，第2管內只有細胞；④染色完成后加入1 mL的PBS洗滌細胞，離心 300 g/5 min；⑤棄去上清，加入 600 μL PBS重懸、混勻細胞，上機檢測。

1.2.4 Real?time PCR檢測用Trizol法提取細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA在逆轉錄酶的作用下反轉錄為cDNA。目的基因β2?M、HLA?E和HLA?A2402及內參GAPDH的引物見表1，實時熒光定量PCR在7500 Software v2.3儀器上進行。根據實時熒光定量PCR中Ct值計算出△Ct值，采用相對定量2-△Ct法比較目的基因mRNA的表達差異，PCR中每個樣本均重復3次，取其平均值。

表1 所檢測目的基因及其引物序列Tab.1 The detected target genes and its primer sequence

1.3 統計學方法所有實驗至少重復3次，數據采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據以表示，兩組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對HepG2細胞內HLA?I mRNA表達水平的影響HepG2細胞經不同濃度二甲雙胍或IFNγ（陽性對照）刺激24 h后，RT?PCR 檢測 β2?M、HLA?E、HLA?A2402表達水平，與對照組（0 mmol/L）相比，0.5、2、5、10 mmol/L二甲雙胍處理均能提高肝癌細胞HepG2中β2?M、HLA?E、HLA?A2402 mRNA表達水平，且5和10 mmol/L二甲雙胍處理后，β2?M mRNA表達水平分別提高了2和2.6倍（圖1）；HLA?E mRNA表達水平分別提高了1.8和2倍（圖2）；HLA?A2420 mRNA表達水平分別提高了1.6和1.9倍（圖3），且上述變化差異均有顯著性（P＜0.01），表明二甲雙胍處理能提高肝癌細胞HepG2中HLA?I mRNA的水平。

圖1 RT?PCR檢測二甲雙胍及干擾素處理后HepG2中β2?M的表達情況Fig.1 Expression of β2?M mRNA in HepG2cell line treated by metformin and interferon

圖2 二甲雙胍及干擾素處理后HLA?E表達水平的變化Fig.2 Changes of HLA?I mRNA levels in HepG2cells treated with metformin and interferon

2.2 二甲雙胍對HepG2細胞膜表面HLA?I蛋白表達的影響經不同濃度二甲雙胍或干擾素處理HepG2細胞24 h后，按照規范的實驗方法制作樣本進行流式上機檢測。結果顯示，與對照組（0 mmol/L）相比，實驗組不同濃度二甲雙胍（0.5～10 mmol/L）并不影響細胞膜表面HLA?I的情況（P＞0.05，圖4）。

圖4 二甲雙胍處理后HepG2細胞表面HLA?I水平變化Fig.4 The effect of metformin on HLA?I on the surface of HepG2cells

3 討論

2005年1份流行病學報告顯示，服用二甲雙胍的糖尿病患者腫瘤發病率明顯低于服用其他降糖藥物的患者[8]。近年來大量研究發現，二甲雙胍對患有肝癌、大腸癌、胰腺癌、胃癌及食管癌的糖尿病患者具有保護作用[9]。2013年來二甲雙胍與腫瘤的臨床試驗也相繼展開。文獻報道[10]，二甲雙胍有望能夠改善乳腺癌的繼發性內分泌耐藥；二甲雙胍能夠通過LKB1?AMPK?mTOR通路抑制腫瘤的生長[11]。本課題組前期研究發現，二甲雙胍可顯著降低肝癌細胞線粒體的活性[12]，且二甲雙胍能夠通過激活AMPK誘導肝癌細胞衰老[13]，二甲雙胍與 5?FU 聯合應用對人結腸癌細胞具有協同抑制作用[14]。此外有研究發現[5]二甲雙胍能夠通過增加CD8+腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）的數量，保護細胞免于衰竭和凋亡，進而發揮其免疫介導的抗腫瘤效應。這些研究都表明二甲雙胍具有抗腫瘤的作用，其可能成為一種新的治療腫瘤的手段，但目前對二甲雙胍抗腫瘤的具體機制尚不完全明確。

有研究表明，在人體黑色素瘤中，HLA?I水平越低，其體內實驗中細胞的致瘤性更強，體外實驗中細胞的增殖率、轉移能力及侵襲力更高[15]。HLA?I的下調會減弱肺癌免疫治療的臨床效果[16]，此外HLA?I的下降和缺失會與腫瘤的侵襲及轉移有關，且HLA?I的水平越低，疾病的預后越差。但與正常細胞相比，癌細胞表面HLA?I水平明顯降低，嚴重影響癌癥患者免疫治療的效果，這也成為癌細胞逃避免疫細胞攻擊和清除的重要誘因。而在黑色素瘤中通過轉染HLA?A2使HLA?I水平升高，可以逆轉由 HLA?I降低引起的高致瘤性[15]。可見通過逆轉腫瘤細胞表面HLA?I表達水平，對尋找腫瘤治療的新靶點及新方法具有重要意義。

本研究首次著眼于探索二甲雙胍對HLA?I所介導的免疫機制對肝癌的影響，研究中發現，5和10 mmol/L二甲雙胍可以顯著提高β2?M、HLA?E、HLA?A2402 mRNA水平，可見二甲雙胍能夠在轉錄水平影響HLA?I表達。雖然流式結果表明，二甲雙胍對細胞表面經典的HLA?I蛋白表達無明顯影響，但HLA?I的功能是與抗原結合后，將抗原遞呈給腫瘤反應性細胞毒性T淋巴細胞，因此當環境中缺少抗原時，HLA的功能不能正常發揮，無法在細胞膜上檢測到HLA?I的明顯變化。且HLA?I的功能不僅受蛋白表達水平影響，也受抗原加工遞呈（antigen?processing machinery，APM）分子的影響[15]，所以二甲雙胍除了調節HLA部分亞型的mRNA表達水平外，也可能通過APM分子間接影響MHC?I的抗原遞呈功能，從而提高腫瘤細胞的抗原性和免疫原性，增強機體對腫瘤細胞免疫監視。此外，二甲雙胍在轉錄水平上顯著提高HLA?I輕鏈及部分重鏈分子的水平，卻未在蛋白水平檢測到類似的改變，推測HLA?I可能受到翻譯及翻譯后修飾的調節。

本研究的實驗環境中缺乏抗原，這也可能是僅有部分亞型的HLA發生顯著變化的原因，因此，為了更深入研究二甲雙胍對肝癌細胞中HLA?I轉錄、翻譯、翻譯后修飾及功能的影響，筆者擬用有效濃度的二甲雙胍處理肝癌HepG2細胞，再用抗原肽刺激該細胞，通過檢測細胞表面抗原肽的表達水平等進一步探討二甲雙胍抗肝癌的免疫學機制。