Mcl?1表達信號通路阻斷劑在H37Ra感染的小鼠模型中的作用

王新敏 王小芳 盧洋 楊菩 韓玲 王英姿 張萬江 章樂

石河子大學醫學院1第一附屬醫院泌尿外科，2病理生理學教研室（新疆石河子 832002）

1 材料與方法

1.1 菌株、實驗動物和阻斷劑本研究所用菌株為結核分枝桿菌國際標準減毒株H37Ra，由中國藥物生物制品檢定所提供并保存。實驗所用小鼠為6～8周齡的SPF級（無特定病原體動物）健康雌性BALB/c小鼠，體質量約（18±2）g，購買于石河子大學實驗動物中心。阻斷劑AG490、PD98059和LY294002購自于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組將實驗小鼠分為H37Ra感染組、阻斷劑+H37Ra感染組（AG490+H37Ra感染組、PD98059+H37Ra感染組、LY294002+H37Ra感染組）和對照組，阻斷劑注射劑量為100 μg/只（實驗組前期篩選），同時設阻斷劑處理后的1、3、5、7 d 4個時間點，每組每個時間點各設10只小鼠，以阻斷劑處理時作為零時[5]。

1.2.2 構建結核分枝桿菌感染小鼠模型在生物安全柜內，用蘇通培養液與生理鹽水的混合物（0.5 mL；體積比為3∶1）稀釋細菌，取100 μL細菌稀釋液涂抹在改良羅氏培養基上。大約2～3周后，取生長狀態良好的菌落，加入少量含有0.05%Tween?80的生理鹽水，于磨菌器中充分研磨成均勻渾濁的菌懸液。將其濃度調整至1.0×107CFU/mL后，抽取0.3 mL腹腔注射到各組小鼠體內[6]。在上述時間點將各阻斷劑經腹腔注入各組小鼠體內。

1.2.3 小鼠腹腔巨噬細胞的收集與提取于上述不同的時間點脫頸處死各組小鼠，將其處理至腹膜完全暴露后，向小鼠腹腔中注入5 mL RPMI?1640培養基，按摩腹部約10 min，反復抽吸數次（避開腸和脂肪），收集所有腹腔液。經1 200 r/min離心5 min后，棄上清，PBS液洗滌1次，加入DMEM培養液（含10%胎牛血清）將細胞重懸。最終，將收集處理好的細胞接種到6孔細胞培養板中，于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h，顯微鏡下觀察，貼壁細胞即為小鼠腹腔巨噬細胞[6]。

1.2.4 TUNEL技術檢測細胞凋亡在室溫下，將上述不同時間提取并培養的小鼠腹腔巨噬細胞固定于4%的多聚甲醛（pH 7.4）上，固定約15 min。PBS沖洗3次，每次5 min后，加入0.1%Triton X?100于冰上裂解細胞約8 min，PBS再次沖洗3次，每次5 min。按照TUNEL試劑盒說明書的步驟操作，凋亡的細胞被TUNEL反應混合物標記出來，TUNEL陽性細胞的數量通過顯微鏡觀察。

1.2.5 結核分枝桿菌菌落計數（CFU）將收集并提取的小鼠腹腔液經6 000 r/min離心20 min，去上清后，加入1 mL 1%Triton X?100裂解液，約10 min后加入1 mL DMEM培養基（含10%胎牛血清）終止裂解。將其振蕩混勻約5 min后，分別進行10-2、10-3和10-4倍稀釋，最終接種于羅氏培養基上。每個稀釋濃度涂抹3個平板，分別置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，21 d后對其進行菌落計數。

1.2.6 細胞免疫化學檢測Mcl?1的表達將上述各組小鼠腹腔巨噬細胞制成細胞涂片，于4℃4%的多聚甲醛中過夜。PBS洗涂片兩次后，10%的胎牛血清中放置30 min，于4℃抗體孵育過夜。所用一抗為兔抗鼠 Mcl?1，濃度為 1∶1 000；二抗為PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，濃度為1∶200。最終，用蘇木素和伊紅（H&E）清洗和復染后，由2位病理學家對其進行免疫組織化學分析，Mcl?1表達的亞細胞位置（細胞核和胞質）被記錄在400×放大的顯微鏡中，并用Mcl?1陽性巨噬細胞的百分比表示，標準參照文獻[7]。

1.2.7 HE染色觀察小鼠臟器的變化在上述不同時間處死小鼠后，立即將其肺、肝、脾、腎取出，固定于10%的福爾馬林中，并用石蠟包埋。經過95%乙醇和無水乙醇脫水處理后，用二甲苯處理約30 min。然后，石蠟包埋、切片、脫蠟處理后，梯度脫水5 min。最后，通過蘇木精和伊紅著色，于顯微鏡下觀察和評估每個圖像中存在的炎癥水平，炎癥區會比非炎癥區染得更濃，從而觀察到細胞或組織的組成和病變。

第二階段為依賴階段，企業己建立較完整的安全條件和紀律約束，員工需要遵守安全規范要求，安全管理不只是安全管理人員的職責，其它員工也有義務參與。

1.3 統計學方法所得實驗數據均通過SPSS 17.0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差描述。當數據資料滿足正態分布時，使用單因素方差分析（ANOVA），應用SNK?q檢驗進行多個樣本均數間的兩兩比較；對于計數資料或計量資料不服從正態性且方差不齊時采用非參數檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 阻斷Mcl?1表達信號通路促進了小鼠腹腔巨噬細胞凋亡應用阻斷劑AG490、PD98059、LY294002阻斷Mcl?1表達后，TUNEL技術檢測了小鼠腹腔巨噬細胞的凋亡率。結果顯示，與對照組相比，H37Ra感染組的凋亡率顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。阻斷劑AG490、PD98059、LY294002作用于H37Ra感染的小鼠后，小鼠腹腔巨噬細胞的凋亡率均呈現不同程度的升高，其中阻斷劑PD98059處理組的凋亡率顯著高于AG490和LY294002處理組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1A）。

2.2 PD98059處理減少了巨噬細胞內結核桿菌的數量考慮到阻斷劑誘導凋亡的效果，檢測了阻斷劑PD98059處理后小鼠巨噬細胞內H37Ra的數量。菌落計數結果顯示，與未處理的H37Ra感染組相比，阻斷劑PD98059處理的H37Ra感染組小鼠巨噬細胞內H37Ra的菌落數量顯著減少（P＜0.05，圖1B），約減少了57.5%（從4.0× 107減少到1.7× 107）。

表1 抑制劑處理的H37Ra感染的小鼠巨噬細胞中Mcl?1的表達和凋亡率Tab.1 The expression of Mcl?1 and macrophages apoptosis rate in mice infected with H37Ra treated with inhibitors

圖1 阻斷劑處理對H37Ra感染的小鼠巨噬細胞凋亡和胞內結核分枝桿菌的影響Fig.1 Effect of inhibitors on apoptosis of macrophages and intracellular MTB in mice infected with H37Ra

2.3 阻斷劑PD98059處理抑制了Mcl?1的表達細胞免疫化學檢測了不同信號通路阻斷劑處理對小鼠腹腔巨噬細胞中Mcl?1表達的影響。數據結果顯示，Mcl?1在H37Ra感染組的小鼠腹腔巨噬細胞中呈現陽性表達（表1）。用阻斷劑AG490、LY294002處理的H37Ra感染的小鼠腹腔巨噬細胞中Mcl?1的表達受到輕微抑制，而阻斷劑PD98059處理組Mcl?1的表達受到明顯抑制。與H37Ra感染組相比，在阻斷劑PD98059處理的H37Ra感染組的小鼠腹腔巨噬細胞中，Mcl?1的表達被顯著抑制，其陽性細胞只有20%（P＜ 0.05，表1）。

2.4 Mcl?1信號通路抑制劑處理減輕了結核感染的小鼠臟器的病理損傷

2.4.1 H37Ra感染組小鼠臟器變化與對照組相比，H37Ra感染組肺臟呈現肺毛細血管和間質大部分區擴張淤血，散在小灶肺間質內淋巴細胞、漿細胞浸潤；肝臟呈現中央靜脈淤血，匯管區灶性淋巴細胞、漿細胞浸潤；脾臟呈現脾紅髓明顯擴張、淤血、出血；腎臟呈現腎間質部分區血管擴張、淤血（圖2）。

2.4.2 阻斷劑處理的H37Ra感染組臟器變化與對照組相比，阻斷劑AG490和LY294002處理減輕了肺臟毛細血管和間質部分區、肝臟中央靜脈、脾臟脾紅髓及腎臟腎間質部分區的擴張淤血程度，而且減少了肝臟匯管區灶性炎性細胞的浸潤（圖2）。阻斷劑PD98059處理明顯減輕了肺臟肺毛細血管和間質、肝臟中央靜脈、脾臟脾紅髓、腎臟腎間質血管的淤血程度，而且脾臟的出血明顯減輕（圖2）。

3 討論

巨噬細胞對抗結核感染的主要宿主細胞，可通過壞死、凋亡和自噬發揮免疫防御機制，影響感染的結局，而凋亡為主的死亡降低了不同真菌和細菌（包括結核分枝桿菌）的生存能力[8-10]。在結核感染期間，巨噬細胞中有多個分子及其相關信號通路參與了宿主細胞凋亡的調控。研究發現，Mcl?1在結核分枝桿菌感染的宿主巨噬細胞凋亡的調控中發揮著重要的作用[4-5，11]。

圖2 阻斷劑處理的H37Ra感染的小鼠臟器的免疫組織變化Fig.2 Immunohistochemical changes of mice infected with H37Ra treated with inhibitors

目前，Mcl?1的表達主要是通過激活Janus激酶/信號傳導及轉錄活化（janus kinase/signal trans?ducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路、磷脂酰肌醇激活（phosphatidylinositol 3?ki?nase，PI?3K）信號通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路來發揮作用[5-6]。JAK/STAT信號通路包括多種生物反應，如細胞增殖、凋亡和免疫系統調節[12]。大量的實驗證實AG490可以促進腫瘤細胞的凋亡，對正常細胞幾乎沒有副作用[13-14]。MAPK通路是MAPK/ERK通路的細胞外信號調節激酶[15]。PI?3K信號通路主要通過影響下游的各種效應分子，發揮抗凋亡作用[16]。當PI?3K信號通路抑制劑LY294002應用于人類巨噬細胞后，Mcl?1的表達水平顯著降低[17]。而根據實驗前期研究結果[4]，本實驗僅分析了阻斷劑處理后第5天Mcl?1干預對小鼠的影響。實驗結果證實，3條信號通路阻斷劑阻斷Mcl?1表達后均能誘導H37Ra感染的小鼠巨噬細胞凋亡，其中以MAPK信號通路阻斷劑PD98059處理組誘導凋亡效果最好（圖1）。此實驗結果證實，阻斷Mcl?1的表達信號通路確實能夠有效增加結核感染的宿主巨噬細胞凋亡。然而，對于Mcl?1信號通路阻斷劑對于結核潛伏感染的消除作用還有待進一步論證。

課題組前期研究結果發現，MAPK信號通路阻斷劑PD98059比PI?3K和JAK/STAT途徑阻斷劑誘導更多的小鼠腹腔巨噬細胞凋亡，且Mc?1蛋白表達明顯下降[11]，因此，筆者推測MAPK信號通路是調控Mcl?1表達的主要通路。細胞免疫化學結果證實了筆者的推測，MAPK信號通路抑制劑PD98059處理H37Ra的小鼠巨噬細胞后，不僅Mcl?1的表達受到明顯抑制（表1），而且宿主巨噬細胞內的菌落數量顯著降低（圖1）。除此之外，阻斷劑PD98059與阻斷劑AG490和LY294002相比，可明顯減輕小鼠肺臟、肝臟、脾臟和腎臟各臟器的壞死程度，使病變程度得到改善（圖2）。毫無疑問，這些結果很直觀地證實，通過阻斷Mcl?1表達的信號通路可有效消除結核桿菌的潛伏感染，而MAPK信號通路是其主要調控通路。

MAPK家族是細胞信號傳導的重要樞紐，一系列的生物因子（如生長因子、淋巴因子、腫瘤促進因子及應激因子等）均可通過膜受體直接激活MAPK通路，從而調控細胞增殖、分化、代謝、凋亡等。而PI?3K信號通路的活化主要是通過RAS?RAF?MEK?ERK通路，間接調控細胞凋亡[18]。JAK/STAT信號轉導通路阻斷劑AG490是通過阻斷多種細胞因子引起的JAK2/STAT3的磷酸化激活，繼而阻斷JAK/STAT信號轉導路徑。結核感染可使JAK2/STAT1?α磷酸化，從而誘導生成大量TNF?α[19]，導致Caspase酶系活性增強，從而啟動細胞凋亡。然而，Caspases酶系可以分解 Mcl?1導致Mcl?1的水平上調。MAPK信號通路阻斷Mcl?1表達時，可通過p38 MAPK和ERK兩個分支拮抗TNF?α降低引起 Mcl?1 上調[5]。因此，當分別應用阻斷劑AG490、PD98059和 LY294002阻斷 Mcl?1的表達時，PD98059處理組作用最顯著。由此可知，利用Mcl?1干預在結核潛伏感染中的特殊作用，有針對性的開發相應的藥物或疫苗，必將加快人類戰勝結核的腳步。

綜上所述，阻斷Mcl?1表達的信號通路可以顯著促進結核感染的小鼠巨噬細胞的凋亡，減少結核桿菌在宿主巨噬細胞內的潛伏，減輕結核感染對小鼠臟器的病理損傷。而MAPK信號通路是此過程中的主要調控通路，PD98059為其特異性抑制劑。此研究從形態學角度分析了Mcl?1干預對結核感染的巨噬細胞的調控作用，不僅為當前耐多藥結核病藥物的研發提供了更多的思路和方向，還為Mcl?1干預應用于結核的預防與控制提供了更多的理論依據。然而，對于MAPK信號通路的詳細調控機制在本研究中并未涉及，這也將是下一步的研究方向。