ESAT?6和CFP?10在感染性脊椎炎鑒別診斷中的作用

孫宇鵬 何少波 張春強 杜開利 郭培宇 趙潤民

昆明醫科大學第一附屬醫院骨科（昆明 650032）

脊椎炎（VO）是一種以特定病原微生物引起，累及椎體、椎間盤及椎體周圍組織的感染性疾病，可由血液傳播、相鄰軟組織感染擴散或脊柱外科手術中直接感染導致[1]，在發達國家年發病率為2.9～ 5.4/10萬，其中年齡＜ 59歲占49.5%[2]。在我國，大部分脊椎炎的病例被診斷為脊柱結核感染，但仍存在較高的誤診率。結核感染T細胞試驗（T?SPOT.TB）是近年應用于結核病臨床診斷的重要方法，其使用的特異性抗原6 kD早期分泌靶向抗原（ESAT?6）和10 kD培養濾過蛋白（CFP?10）均不存在于卡介苗開放讀碼框中，因此不受卡介苗影響從而大大提高MTB感染的檢出率，目前國內外許多研究證實T?SPOT.TB在診斷結核感染中具有較高的敏感度及特異度[3]。該方法以特異性抗原ESAT?6、CFP?10為刺激源，檢測外周血中釋放IFN?γ的特異性T細胞數量從而判斷是否為MTB感染。結果由ESAT?6、CFP?10斑點計數決定，其中任意一個抗原斑點計數結果判定為陽性，則T?SPOT.TB結果為陽性。但在兩種抗原刺激下，分泌IFN?γ的T細胞數量并不一樣，便出現了兩種抗原診斷結果不一致的情況。且T?SPOT.TB目前主要運用于肺結核領域，在脊柱結核病中的研究報道較少，且 T?SPOT.TB結果中ESAT?6、CFP?10在不同類型感染性脊椎炎鑒別診斷中的作用和效率相關研究較少。本研究通過脊椎炎患者外周血檢測T?SPOT.TB結果中ESAT?6、CFP?10斑點計數進行分析，評價兩種抗原在各種不同類型的脊椎炎鑒別診斷的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料資料來源于2014年7月至2017年7月就診于我院脊柱外科，根據臨床表現、一般實驗室檢查、感染相關指標檢查及影像學檢查，并最終通過血培養、病理組織學和膿液培養等手段明確病原學診斷患者共59例。見表1。

表1 59例脊椎炎患者一般資料及其T?SPOT.TB結果Tab.1 59 cases of patients with general information and their T?SPOT.TB results±s

表1 59例脊椎炎患者一般資料及其T?SPOT.TB結果Tab.1 59 cases of patients with general information and their T?SPOT.TB results±s

例數T?STOP.TB ESAT?6CFP?10陽性例數項目性別男女年齡35 24 14.62±32.08 34.12±32.00 33.14±55.17 28.41±40.80 19 18＜30 30～60≥60病變部位頸椎胸椎胸腰椎腰椎病種結核性脊椎炎布魯氏菌性脊椎炎化膿性脊椎炎13 36 10 25.84±26.47 20.91±33.89 24.20±40.96 55.69±62.46 23.83±45.22 26.00±38.97 11 21 150 18 4 36 41.16±42.95 11.50±6.60 15.40±26.09 48.83±57.51 97.75±81.44 16.34±31.14 5 0 1 5 4 1 8 38 11 10 34.23±36.47 2.54±3.90 0.20±0.42 48.02±55.00 1.27±1.34 0.3±0.67 35 20

1.2 T?SPOT.TB檢測方法及結果判定采用Ox?ford Immunotec公司T?SPOT.TB試劑盒，按照試劑盒說明書正確操作。陽性結果判定：空白對照斑點數≤5時，A抗原或B抗原斑點計數-空白對照孔斑點計數≥6；空白對照孔斑點計數6～10個時，A抗原（ESAT?6）或B抗原（CFP?10）孔斑點數≥2×空白對照孔斑點計數。如不符合上述標準且陽性質控對照孔正常時檢測結果為陰性。空白對照孔斑點計數超過10個時、陽性質控對照孔斑點數小于20個時，檢測結果被認為是“不確定”。T?SPOT.TB檢測操作及結果判讀由同一位醫師完成。

1.3 統計學方法應用SPSS 23.0統計分析軟件進行分析并繪制ROC曲線，計量資料用表示，計數資料組間比較采用χ2檢驗；一致性檢驗采用kappa分析，率的比較采用McNemer檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 7.0繪制散點圖并進行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 T?SPOT.TB結果38例結核性脊椎炎組患者中有35例陽性，21例非結核性脊椎炎組中2例結果為陽性，該2例患者最終明確診斷為布魯氏菌性脊椎炎。T?SPOT.TB檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為92.10%、90.47%、94.59%、86.36%。T?SPOT.TB檢測在結核性脊椎炎與非結核性脊椎炎陽性檢出率差異有統計學意義（χ2=39.445，P=0.00）（表2）。

37例陽性結果中，僅ESAT?6陽性7例，僅CFP?10陽性3例，ESAT?6、CFP?10均陽性27例。繪制59例脊椎炎患者ESAT?6、CFP?10斑點計數散點圖（圖1），最終診斷為非結核脊椎炎病例2例陽性患者結果均為僅ESAT?6陽性（2例ESAT?6/CFP?10斑點數分別為11/1和9/1）。

表2 結核性脊柱炎與非結核性脊柱炎卡方檢驗Tab.2 The chi?square test results of TVO and non?TVO

對38例結核患者T?SPOT.TB結果中ESAT?6、CFP?10斑點計數進行獨立樣本t檢驗（圖2），ESAT?6及CFP?10斑點計數在結核性脊椎炎患者中差異沒有統計學意義（t=1.288，P=0.201）。

2.2 ROC曲線分析ESAT?6、CFP?10 對59例T?SPOT.TB結果ESAT?6、CFP?10斑點計數進行ROC曲線分析，ESAT?6、CFP?10曲線下面積分別為0.954、0.893。均取斑點計數≥6的最小坐標點（ESAT?6斑點計數 =6.5、CFP?10斑點計數 =7），ESAT?6敏感度與特異度分別為0.842、0.905（Youden index=0.747），CFP?10敏感度及特異度分別為0.763、1.000（Youden index=0.690）（圖3）。

圖1 59例脊椎炎患者ESAT?6、CFP?10斑點計數散點圖Fig.1 The scatter diagram of ESAT?6 and CFP?10 spot counts by 59 cases of patients with VO

圖2 結核性脊柱炎（n=38）ESAT?6、CFP?10斑點計數獨立樣本t檢驗Fig.2 The t?test results of ESAT?6 and CFP?10 by patients with TVO（n=38）

2.3 ESAT?6、CFP?10與病原學診斷結果一致性分析ESAT?6斑點計數McNemer結果顯示與病原學診斷結果差異無統計學意義（P=0.289），診斷存在一致性（kappa=0.716，P′＜0.05），但病原學診斷結果一致性一般；CFP?10斑點計數McNemer結果顯示與病原學診斷結果差異有統計學意義（P=0.008），且CFP?10診斷陽性率明顯較差，為50.8%（30/59），診斷結果存在一致性（kappa=0.727，P′＜0.05），與病原學診斷結果一致性一般。ESAT?6與CFP?10進行kappa一致性分析，McNemer結果顯示診斷情況一樣（P=0.344），一致性一般（kappa=0.660，P＜0.05）（表3）。

3 討論

各種類型的脊椎炎因為起病隱匿、臨床癥狀不典型，早期診斷及鑒別診斷一直困擾著外科醫生。盡管隨著影像學及實驗室檢查的發展，但脊椎炎的早期診斷及鑒別診斷依然較為困難，極易誤診。脊椎炎可發生于各年齡段，呈現雙峰分布，第一個高峰于20歲左右，第二個高峰出現在50～70歲，男女比例在為2∶1到5∶1之間[4]。疼痛為典型首發癥狀，其癥狀取決于病變位置，化膿性脊椎炎腰椎病變較為常見，其次是胸椎，頸椎較少見，90%結核性脊椎炎發生在胸和腰椎[5]。隨著抗生素的普及和應用，脊椎炎的發病率正在上升。但隨著卡介苗的接種及抗結核藥物的使用，非特異性脊椎炎發病率明顯高于結核性脊椎炎，且非特異性脊椎炎發病率超過結核性脊椎炎的3倍[6]。

圖3 59例患者ESAT?6、CFP?10斑點計數ROC曲線分析Fig.3 The ROC curve analysis of ESAT?6 and CFP?10 spot counts

表3 ESAT?6、CFP?10與診斷結果一致性分析Tab.3 The consistency analysis of two antigens and consistency analysis

MRI敏感性及診斷正確率較高，典型結核性脊椎炎MRI中，病變椎體T1WI呈現均勻低信號，T2WI呈現不均勻高信號[8]。但大多數結核性脊椎炎患者的MRI為非典型表現。因此，臨床表現及影像學檢查較難區分不同類型的脊椎炎。而較為常用的實驗室檢查區分不同類型的脊椎炎敏感性較低、特異度較差，血、膿液培養檢出率較低，活檢為有創操作存在一定風險，因此靈敏度及特異度均較好的T?SPOT.TB引入我國后便迅速廣泛應用于臨床。

T?SPOT.TB在結核性脊椎炎中的敏感度、特異度報道不一，敏感度為77%～91%，特異度為77%～94%[9-14]。但研究資料多為結核性脊椎炎患者與健康患者，并不能體現T?SPOT.TB及結果中ESAT?6、CFP?10在脊椎炎鑒別診斷中應用價值。因此本研究中59例均為脊椎炎確診患者，其敏感度及特異度為92.10%、90.47%。特異性與大多數研究結果一致，而敏感度稍高，可能與本組樣本量較少有關。

從兩種抗原斑點計數的散點圖可知，ESAT?6分布較為集中，而CFP?10分布較為分散，未出現假陽性結果，提示了ESAT?6可能具有較高的敏感度，而CFP?10具有較高的特異度。因此，本研究進一步進行了ESAT?6及CFP?10斑點計數的ROC曲線分析，結果顯示無論是 ESAT?6、CFP?10在ROC曲線分析中均具有較高的敏感度和特異度。因此，ESAT?6、CFP?10斑點計數結果可較為靈敏的鑒別結核及非結核性脊椎炎。但ESAT?6具有較高的靈敏度而CFP?10具有較高的特異度，這也與前面散點圖分析結果相一致。同時也和2例假陽性患者T?SPOT.TB結果中CFP?10正確報告為真陰性而ESAT?6報告假陽性相符合。而在一致性分析中，ESAT?6與病原學診斷結果一致性較好，而CFP?10正確診斷陽性率稍差為50.8%，這可能與CFP?10具有較高的特異性有關。

盡管T?SPOT.TB敏感度及特異度較好，但仍存在一些缺點：（1）ESAT?6及 CFP?10主要存在于MTB復合群，但仍然存在于少數非結核分枝桿菌中，如堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、轉黃分枝桿菌和胃分枝桿菌，因此T?SPOT.TB并不能區分上面幾種非結核分枝桿菌感染。（2）T?SPOT.TB并不能區分MTB攜帶者和MTB感染者[13]，且潛伏性結核感染斑點數有可能高于活動性結核，原因可能是：（1）潛伏性結核感染者免疫功能較好，少量的抗原刺激便激發了出活躍的保護性免疫；（2）活動性結核患者免疫功能低下，大量抗原刺激也不足以激起有效的細胞免疫。這也解釋了本研究中有假陽性的結果出現，可能為MTB攜帶者的兩例布魯氏菌性脊椎炎患者導致敏感度較高的ESAT?6呈現假陽性結果。而相比之下敏感度較低、特異度較高的CFP?10在可能為攜帶者的兩例布魯氏菌性脊椎炎中沒有出現假陽性結果，但也因此可能導致了CFP?10在本研究中呈現了假陰性率較高、與病原學診斷一致性較差且可信度相對較低的結果。

綜上所述，ESAT?6具有較高的敏感度，且與病原學診斷結果情況一致性較好。并且具有較高的可信度應用于各種類型脊椎炎的鑒別診斷中。因本組病例較少，當ESAT?6斑點計數較高但CFP?10斑點計數較低時是否可以排除結核性脊椎炎，有待大數據ROC曲線進一步研究。