Th1/Th2、Treg/Th17細胞平衡在慢性乙型肝炎發病機制中的作用

胡萍 王芳 周星

武漢市金銀潭醫院感染性疾病科（武漢 430000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）與肝硬化、肝細胞癌發生密切相關，嚴重影響人體健康，適應性免疫在CHB發病中起著重要作用[1]。在適應性免疫中，輔助性T細胞（helper T cell，Th）主要通過調節免疫應答和刺激B細胞產生抗體而發揮作用。最先被發現的兩類輔助性T細胞分別為Th1細胞和Th2細胞。后繼又發現了其他輔助性T細胞，包括Th17、調節性T細胞（regulatory cell，Treg）、Th22、Th9和濾泡輔助性T細胞（follic?ular helper T cell，Tfh）。各類細胞通過分泌不同的細胞因子，參與炎癥、腫瘤及自身免疫反應等過程[2]。CHB的發病與乙型肝炎病毒（hepatitis B vi?rus，HBV）感染后所介導的免疫損傷和慢性炎癥有關[3]。Th1/Th2、Th17/Treg細胞亞群變化在CHB中的作用備受關注，但在CHB中關于Th1/Th2、Th17/Treg細胞亞群失衡的研究尚少[4?5]。本研究通過檢測CHB患者外周血中Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡及相關細胞因子的表達，探討Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡在CHB炎癥免疫中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2016年1月至2017年6月間，我院就診的64例CHB患者為CHB組，其中男33例，女31例，年齡（38.9±10.2）歲。納入標準：（1）滿足《慢性乙型肝炎防治指南》[6]中CHB診斷標準；（2）排除其他病毒感染、免疫相關性疾病和使用免疫調節劑導致肝功能障礙者；（3）無心腦血管疾病；（4）對本研究知情同意，并簽署同意書。選取同期66例健康體檢者為對照組，即NC組，其中男35例，女31例，年齡（40.1±14.6）歲。兩組性別、年齡差異均無統計學意義。本研究征得患者同意并經醫院倫理委員會批準實施。

1.2 主要儀器與試劑恒溫細胞培養箱購自美國Thermo公司，酶標儀購自美國BD公司，流式細胞儀購自美國BD公司，佛波脂、離子霉素、莫能霉素購自美國Sigma公司，RPMI1640培養液購自美國Gibco公司。一抗、二抗均購自美國BD公司。白細胞介素17（interleukin?17，IL?17）、白細胞介素23（interleukin?23，IL?23）、白細胞介素 4（interleu?kin?4，IL?4）、白細胞介素 10（interleukin?10，IL?10）、轉化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）、γ干擾素（Interferon?γ，INF?γ）ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Th1、Th2、Th17及Treg測定采用流式細胞儀檢測：500 μL全血加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，混勻。每管分別加入佛波脂20 ng/mL、離子霉素1 mg/mL、莫能霉素10 ng/mL，再次混勻。放置于37℃5%CO2恒溫細胞培養箱孵育4.5 h。孵育后混勻，取出血樣每個流式管加入100 μL，共6管，每管加入3～4 mL溶血劑，顛倒混勻，放置8 min，溶解紅細胞。離心洗滌1次。每管加入胞外抗體白細胞分化抗原4（cluster of dif?ferentiation4，CD4）、白細胞分化抗原 8（cluster of differentiation8，CD8），避光4℃孵育20 min，取出后PBS洗滌1次，加入破膜劑避光孵育20 min，取出后磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered saline，PBS）洗滌1次，Th1、Th2、Th17、Treg檢測流式管內分別加入INF?γ、IL?4、IL?17胞內抗體，避光孵育20 min，PBS洗滌 1次后加入 500 μL PBS后上機檢測。

1.3.2 細胞因子檢測IL?17、IL?23、TGF?β1、IL?4、INF?γ、IL?10細胞因子采用ELISA檢測，收集外周靜脈血5 mL，經2 500 r/min離心后收集血清，具體實驗操作根據ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.3 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的測定兩組ALT、AST結果由本院檢驗科統一測定。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件行統計分析，計量資料以表示，計數資料以例（%）表示，計量資料兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組ALT、AST比較CHB組ALT高于NC組（P=0.031），CHB組 AST高于 NC組（P=0.026）。見表1。

表1 兩組ALT、AST比較Tab.1 Compare of ALT，AST between two groups x ± s，g/L

2.2 兩組Th1、Th2、Th17及Treg的比較外周血中Th1細胞占CD4+比例CHB組顯著高于NC組（P=0.012），Th2細胞占CD4+比例CHB組顯著低于NC組（P=0.021），Th17細胞占CD4+比例CHB組顯著高于NC組（P=0.032），Treg細胞占CD4+比例CHB組顯著低于NC組（P=0.027）；Th1/Th2、Th17/Treg細胞比例在CHB顯著高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組IL?17、IL?23、TGF?β1、IL?4、INF?γ、IL?10的比較與NC組相比，CHB組患者外周血IL?4、IL?10濃度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；IL?17、IL?23、TGF?β1及 INF?γ濃度增高（P＜0.05）。見表3。

3 討論

CHB發病機制目前尚不完全清楚，普遍認為其發病與宿主免疫調節紊亂導致的病理損害有關。當機體感染乙肝病毒時，細胞免疫啟動，急性肝炎患者會產生強烈的、非特異性的細胞毒性T淋巴細胞和Th細胞反應，而CHB患者免疫反應較弱，甚至不能檢測到特異T細胞反應，從而導致病毒感染持續存在。乙肝患者體內存在Thl/Th2細胞及其相關細胞因子的失衡，但是目前研究結論存在一定爭議[7?12]。有研究[10]認為，CHB中Th2細胞表達顯著增高，也有研究稱CHB患者外周血中Th1及其所分泌的細胞因子IFN?γ較正常對照組并無顯著改變[11]。而 FENG 等[12]研究結果認為CHB患者肝炎活動時Th1細胞占優勢，而Th2細胞無論在CHB活動期與非活動期間差異均無統計學意義。本研究顯示在CHB組中Th1占優勢，而Th2相對減少，Th1/Th2平衡向Th1方向偏離。同時，Th1分泌的細胞因子IFN?γ，CHB組顯著高于NC組，這也與Th1/Th2平衡偏移方向一致。既往研究發現肝移植后HBV復發患者肝內IFN?γ和TNF?α的產生與肝細胞壞死呈正相關。本研究和既往研究均證實Th1細胞產生的細胞因子與肝損傷相關，而Th2與對抗病毒感染相關，Th1細胞增強了細胞免疫作用，同時增加了肝臟的炎癥反應[13]。

表2 兩組Th1/Th2、Th17/Treg的表達變化Tab.2 The change of Th1/Th2，Th17/Treg between two groups±s

表2 兩組Th1/Th2、Th17/Treg的表達變化Tab.2 The change of Th1/Th2，Th17/Treg between two groups±s

注：與NC組比較，aP＜0.05

組別CHB組NC組t值P值Th1（%）17.85±1.92a 12.25±1.23 23.429 0.012 Th2（%）1.39±0.37a 2.47±0.83 16.109 0.021 Th1/Th2 6.98±2.54a 4.26±1.74 11.056 0.029 Th17（%）2.36±1.09a 1.58±0.42 9.225 0.032 Treg（%）3.39±1.23a 5.58±1.96 13.493 0.027 Th17/Treg 0.98±0.46a 0.26±0.09 3.152 0.038

表3 兩組IL?17、IL?23、TGF?β1、IL?4、INF?γ、IL?10蛋白表達Tab.3 The expression of IL?17，IL?23，TGF?β1，IL?4，INF?γ and IL?10 protein between two groups x ± s

Th17/Treg平衡失衡與CHB的疾病發展和緩解密切相關[14]，Th17細胞在HBV感染時起促炎作用，加重肝細胞損傷[15]。而Treg細胞主要存在于抑制炎癥免疫應答過程中[16]，兩者相互抑制共同作用。研究[17]發現，Th17與Treg細胞在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病階段存在免疫失衡，在免疫耐受階段，Treg細胞發揮主要作用，在嚴重炎癥活動階段，Th17細胞發揮主要作用。本研究顯示，在CHB患者外周血中Th17比例增高，Treg細胞比例降低，Th17/Treg平衡向Th17偏移，Th17釋放的促炎細胞因子IL?17、IL?23增多，促使CHB患者肝細胞炎癥加重，加重肝細胞損傷。同時CHB組的TGF?β1顯著高于NC組，該結果是由于TGF?β1可能誘導初始T細胞向Th17分化，TGF?β1含量在CHB組高于NC組更能說明其可能在CHB中存在一個正向調控Th17表達的作用[18]。本研究結果與既往研究結果一致，可認為CHB患者中Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡在CHB發病中起到重要作用。兩個平衡偏移，引發其釋放的細胞因子的改變，導致一系列細胞因子的網絡反應。本研究還提示，在CHB組AST、ALT均顯著高于NC組，提示Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡與肝細胞損傷、肝功能下降直接相關。

綜上，Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡可能通過其所產生的細胞因子改變在CHB發病中發揮作用。