血清Semaphorin3A的水平與絕經后骨質疏松婦女的骨密度和骨轉換指標關系的研究

郭君紅 宋曉婕 周潔瓊 劉麗平 聶華 田萍 徐亮

1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（武漢市婦幼保健院）（武漢 430015）；2長江航運總醫院武漢腦科醫院（武漢430000）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一多因素病因引起的慢性進展性疾病，以骨量低下、骨微結構破壞和骨強度下降導致骨脆性增加、易發生骨折為特征，其嚴重并發癥為骨折[1]，從而影響患者的身心健康及帶來經濟負擔，是一較常見的骨代謝疾病。其中絕經后骨質疏松癥（postmenopausal os?teoporosis，PMOP）屬原發性高代謝轉換型OP，好發于絕經后的中老年婦女，主要因同時存在雌激素缺乏、持續的鈣丟失和骨老化等多因素，骨代謝在絕經前后的時間開始快速丟失，骨吸收量明顯高于骨形成量，致使骨量逐漸丟失、骨密度隨之下降，進而發生高轉換型的絕經后骨質疏松癥[2]，最后導致骨折風險相應增加。據統計，全球60～70歲女性1/3以上患有骨質疏松，50歲以上女性有1/3因骨質疏松而骨折[3]。預防和認識骨質疏松是減少此種情況影響的一線措施[4]。

健康成人體內，成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收維持著正常的骨代謝穩態，骨組織通過不斷地重塑來保持骨的完整性及礦物質的內穩定，骨骼的自我穩態是在內分泌系統、免疫及神經系統的多種途徑的調控下實現的[5]。骨形成與骨再吸收之間的不平衡可導致骨質疏松癥等骨代謝疾病[6]。

Semaphorins家族近年來廣受關注，具有重要免疫調控作用的神經軸突導向因子，最初由KOLODKIN等[7]在20世紀90年代中發現。日本學者 TAKAYANAGI等[8]研究發現該家族成員 sema?phorin3A（Sema3A）可以通過抑制破骨細胞的骨重吸收和增加成骨細胞的骨形成來發揮雙向調節的骨保護作用，其實驗發現semaphorin?3A缺陷小鼠除了會呈現一種骨質破壞的表型，也會表現出骨合成調節因子和成骨細胞數量的減少，而靜脈注射semaphorin?3A可以預防卵巢切除引起的骨丟失。

目前研究人體內血清Sema3A的水平與絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）婦女的關系的研究尚少。LIU等[9]研究證實PMOP婦女的血清sema3A水平與骨形成標志物骨鈣素（osteocalcin，OC）呈正相關（r＝ 0.077，P＝0.025），從而支持sema3A在小鼠研究中的骨保護作用。而Sema3A水平與骨形成標志物I型前膠原氨基端前肽（procollagen type I amino?ter?minalpropeptide，PINP）的關系研究尚未見報道，本實驗旨在研究PMOP婦女血清Sema3A的水平與BMD、骨形成標志物PINP、骨吸收標志物I型膠原交聯C?末端肽（C?terminal crosslinking of type I collagen，CTX）的相關性，以進一步豐富臨床數據庫，為抗骨質疏松藥物的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例及標本收集2017年1月至2017年12月在本院門診就診的85例PMOP婦女，其絕經期在2年以上10年以下，詳細詢問既往疾病史，排除以下情況：（1）糖尿病、甲亢、惡性腫瘤等影響骨代謝的其他內分泌疾病或慢性疾病；（2）受檢前（半年內）使用影響骨代謝的藥物如大劑量鈣劑、雌激素、雄激素、二磷酸鹽、皮質激素等；（3）近3月內采用激素替代治療；（4）既往放療；（5）異常的肝腎功能檢測。同期收集在本院體檢健康的90例絕經后婦女作為對照組，6個月內未使用過免疫增強或抑制劑，研究前所有受試者均簽署知情同意書。受試者于上午7：30～9：30之間采集空腹靜脈血，分裝入不含抗凝劑的離心試管中并靜置，在1 h內以2 000 r/min離心，所得血清置于-80℃冰箱冷凍保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 骨密度測定采用美國Hologic?QDR?4 500 W雙能X線骨密度儀（dual?energy X?ray ab?sorptiometry，DEXA）進行骨密度的測量，測定部位為腰椎（L2?4）前后位，每日測前均行體模測試，測量的變異系數（cv）＜1%。OP診斷標準：參照國人OP的診斷標準[10]，骨密度低于峰值骨量的2倍標準差以上為骨質疏松，骨密度大于峰值骨量的1倍標準差為骨質正常。

1.2.2 血清Sema3A的測定采用Santa Cruz公司的酶聯免疫吸附試驗（enzyme?linked immunosor?bent assay，ELISA）試劑盒測定，最終反應板在DYNA TECH?MR500型酶標測定儀于450nm處讀取吸光度（A）值。每例血清樣本皆設正、副2個測試孔，取其平均A值。所測值按標準曲線換算成Sema3A含量。

1.2.3 血清I型前膠原氨基端前肽（procollagen type I amino?terminalpropeptide，PINP）、血清I型膠原交聯C?末端肽（C?terminal crosslinking of type I collagen，CTX）的測定采用羅氏自動電化學發光系統檢測，試劑由羅氏公司提供，PINP、CTX的批 內變異系數（CV）分別為4.6%、4.0%，PINP、CTX的批間CV均＜6.0%。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件處理數據，數據以均值±標準差表示，組間均數比較用t檢驗；參數間的相互關系用直線相關分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 絕經后骨質疏松組患者與對照組的基本特征描述兩組研究人群的一般資料及測量指標見表1。絕經后骨質疏松組和對照組的年齡、絕經年限、身高、體重、BMI無明顯差異（均P＞0.05）。絕經后骨質疏松組的腰椎BMD（0.845±0.079）g/cm2明顯低于對照組（1.149±0.069）g/cm2，P＜0.01。絕經后骨質疏松組的血清CTX（0.524±0.026）ng/mL、PINP（54.64± 8.79）ng/mL水平均明顯高于對照組（0.413±0.025）ng/mL和（45.13±9.16）ng/mL，均P＜0.01。絕經后骨質疏松組的Sema3A（4.20±0.59）ng/mL明顯低于對照組（6.89±1.06）ng/mL，P＜0.01。絕經后骨質疏松組與對照組血清鈣、血清磷比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 腰椎BMD與血清CTX、PINP的相關性直線相關分析顯示：絕經后骨質疏松組的腰椎BMD與血清CTX、PINP均呈負相關（分別r＝-0.513，r＝-0.236，均P＜ 0.05），對照組的腰椎BMD與血清CTX、PINP亦均呈負相關（分別r＝-0.484，r＝-0.210，均P＜ 0.05）。

表1 兩組人群的一般資料及生化指標Tab.1 The general materials and biochemical markers in two groups ±s

表1 兩組人群的一般資料及生化指標Tab.1 The general materials and biochemical markers in two groups ±s

變量年齡（歲）絕經年限（年）身高（cm）體重（kg）BMI（kg/m2）腰椎 BMD（g/cm2）PINP（ng/mL）CTX（ng/mL）Sema3A（ng/mL）血清鈣（mmol/L）血清磷（mmol/L）絕經后骨質疏松組（n=85）56.7±6.3 6.5±2.3 155.3±4.8 56.2±7.4 23.0±2.8 0.845±0.079 54.64±8.79 0.524±0.026 4.20±0.59 2.32±0.15 0.98±0.15對照組（n=90）56.4±6.1 6.7±2.5 155.5±5.0 56.4±7.6 23.2±3.0 1.149±0.069 45.13±9.16 0.413±0.025 6.89±1.06 2.34±0.17 1.04±0.13 P值0.745 0.18 0.245 0.741 0.196＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05

2.3 絕經后骨質疏松組血清Sema3A水平與各參數間的相關性85例絕經后骨質疏松婦女的血清Sema3A水平與腰椎BMD值呈顯著正相關（r＝0.598，P＜0.01），與骨吸收指標CTX值呈顯著負相關（r＝-0.629，P＜0.01），與骨形成指標PINP值呈較弱負相關（r＝-0.158，P＜ 0.05）。血清Se?ma3A水平與患者的年齡、BMI之間無相關性（均P＞0.05）。見表2。

表2 絕經后骨質疏松婦女血清Sema3A水平與各參數間的相關性Tab.2 The association between serum Sema3A level and parameters

3 討論

3.1 BMD與血清CTX、PINP的關系骨密度，即單位體積或單位面積的骨量，是人體骨骼強度的重要指標。能夠準確反應骨質疏松的程度[11]。骨密度測量方法較多，DEXA法測定的骨密度是全球公認的OP診斷金標準。本研究采用DEXA骨密度儀測量絕經后女性腰椎（L2～L4）骨密度，結果顯示絕經后骨質疏松組腰椎（L2～L4）骨密度明顯低于對照組（P＜0.01）。骨代謝生化指標是骨組織本身的代謝（分解與合成）產物，分為骨形成標志物和骨吸收標志物，前者反映成骨細胞活性及骨形成狀態，后者代表破骨細胞活性及骨吸收水平[12]。骨代謝生化指標靈敏度高、易于檢測，獨立于年齡、骨密度等骨質疏松性骨折的風險因素，通過反映全身骨代謝的變化而反映骨質疏松性骨折的風險[13]。β?CTX和 PINP是國際骨質疏松癥基金會推薦使用的骨代謝指標。CTX反映破骨細胞的活性，是敏感特異的骨吸收標志物[14]，PINP反映成骨細胞的活性，是敏感而特異性強的骨形成指標[15]。聯合檢測骨形成和骨吸收指標能對骨轉換進行分型，預測骨丟失率，可用于鑒別個體是否存在快速骨丟失及易患骨質疏松，選擇恰當的干預措施。本研究顯示絕經后骨質疏松婦女骨吸收指標CTX水平與骨形成指標PINP水平均高于正常對照組，B M D與CTX和PINP成負相關，與文獻報道[16]相近。反映了絕經后患者的骨代謝中破骨細胞活動加強，骨轉換增加，絕經后骨質疏松癥的發生可能是骨吸收的速度超過骨形成的速度所致，骨形成的增加繼發于骨吸收的增加，是機體代償的結果，這不同于老年性骨質疏松癥。

3.2 血清Sema 3A與BMD、血清CTX、PINP的關系Sema3A是一種可溶性Ⅲ類軸突導向蛋白成員，其僅在成骨細胞中表達，與其受體神經纖毛蛋白1（neuropilin?1，NRP1）一起參與軸索導向及調節免疫反應等各種生理過程。研究TAKAYANAGI等[8]發現Sema3A可對破骨細胞和成骨細胞進行雙重調節，Sema3a-/-小鼠和NrpISema?小 鼠（表達的NRP1缺乏Sema結合位點）有嚴重的骨病，表現為破骨細胞數量增加和成骨細胞數量減少。重組Sema3A經靜脈注射至正常小鼠，可導致破骨細胞減少和成骨細胞增加，促進骨量積累。此外，用Sema3A治療鉆洞損傷誘導的小鼠骨缺損模型，可促進骨再生，并降低去勢小鼠的骨質流失。作為目前發現的唯一可對成骨細胞和破骨細胞進行雙重調節的信號通路，Sema3A/Nrp1對受損骨神經的軸突再生、骨骼發育和骨重建具有調控作用，在骨形成和骨吸收過程中具有重要意義[17-18]。

Sema3A對骨代謝的作用已得到研究的證明，但檢測PMOP婦女血清中Sema3A的水平與骨代謝的國內外臨床實驗的研究尚少。LIU等[9]研究證實PMOP婦女的血清sema3A水平與骨形成標志物OC呈正相關，從而支持sema3A在小鼠研究中的骨保護作用。本實驗研究發現絕經后骨質疏松組血清Sema3A明顯低于對照組，并且Sema3A水平與BMD呈正相關，與骨吸收指標CTX水平呈負相關，Sema3A與患者年齡、BMI間無相關性，表明Se?ma3A可能參與了絕經后骨質疏松發病過程，在骨轉換中發揮作用。近年來研究發現，Sema3A對成骨細胞和破骨細胞的雙重調節的分子機制。叢狀蛋白A（PlexinA）家族是Sema3A的主要受體，它和Nrpl形成受體復合物。PlexinAl在髓系細胞觸發受體 2（triggering receptor expressed on myeloidcells?2，TREM2）和自然殺傷激活受體相關蛋白12（DNAX?activating protein of 12 kU，DAPl2）形成PlexnAl?TREM2?DAPl2復合體，為破骨細胞分化提供共刺激信號。Sema3A?Nrpl軸通過干擾PlexinAl和TREM2?DAPl2的相互結合來抑制RANKL誘導下的破骨細胞分化[19]，而破骨細胞分化及功能成熟，必須依賴于RANKL?RANK通路的激活。RANKL蛋白通過特異性結合破骨前體細胞膜上的RANK受體，促發級聯反應，通過激活下游TRAF6?NF?κB和AP?1轉錄因子復合體（包括c?Fos）兩條通路，從而激活活化T細胞核因子1蛋白（NFAT?cl），促進破骨細胞特異性基因ctsk、Acp5和Nfatcl表達，誘導前體細胞向成熟的有功能的破骨細胞分化。此外，Sema3A?Nrpl軸還可抑制RhoA的激活來阻止破骨前體細胞的分化。另外HAYASHI等[8]還發現，sema3A能抑制巨噬細胞集落刺激因子對骨髓源性單核／巨噬前體細胞的趨化作用，從而防止該細胞向骨吸收區遷移，減少對骨質破壞；Sema3A通過經典的Wnt?β?鏈蛋白信號通路來調節成骨細胞分化[20]。經典Wnt通路是促進成骨細胞分化的重要信號通路，其主要通過激活Racl表達，使β?catenin即β鏈蛋白在胞核內定位實現。sema3A與成骨細胞中的受體結合后可借助FARP2（一種鳥嘌呤核苷酸交換因子）上調Racl的表達，使β鏈蛋白在胞核內聚集，從而促進成骨細胞分化及功能成熟。

本研究顯示絕經后骨質疏松患者的血清Se?ma3A水平降低，使成骨細胞活性減弱，破骨細胞活性增強，骨形成減低，骨吸收增加，骨量減少導致BMD降低。Sema3A水平降低可能是絕經后骨質疏松發生的重要原因之一。表明Sema3A在絕經后骨質疏松中的正性調節作用，對絕經后骨質疏松的治療提供了新思路，并且外周血Sema3A水平反映了骨丟失的嚴重性，可用于監測治療骨質疏松藥物的效果。而Sema3A水平與骨形成指標PINP水平亦呈負相關，后者可能由于絕經后骨質疏松婦女的高骨轉換率，機體代償性骨形成增加導致。