酸提山楂果膠理化特性及抗氧化性

吳瞻邑,劉素穩,崔麗賢,常學東,*

(1.河北科技師范學院食品科技學院,河北秦皇島 066604;2.河北省農林科學院昌黎果蔬研究所,河北昌黎 066600)

山楂(FructusCrataegi)是薔薇科蘋果亞科山楂屬(CrataeguspannatifidaBge. Var. major N. E. Bge),其味酸甘、性微溫,其各部分均可入藥。近年來,國內外學者對山楂中的成分、醫藥、生物、品質與品種各個方面都做了大量的研究工作，并取得了較大進展[1]。目前,對山楂的加工利用主要在山楂制品方面[2],另一主要方面是從山楂中提取黃酮類化合物[3]等。山楂中含有大量的果膠物質,其含量居水果之首,鮮山楂中果膠含量達6.4%,可以作為優質的果膠原料[4]。果膠是一類酸性雜多糖,并且結構復雜,主要存在于高等植物的細胞壁和細胞內層,它的主要作用就是將細胞粘合在一起[5]。GB25533-2010規定了商品化果膠的半乳糖醛酸含量,其含量必須在65%以上。果膠還有一定的抗氧化功能,據報道,蘋果果膠的活性氧消除能力非常強[5],大葉海(SeagrassZosteramarina)果膠可以降低小鼠肝臟的丙二醛[6]。

目前我國山楂加工技術落后,深加工產品較少,產品附加值低,造成了山楂資源嚴重浪費,山楂的開發和應用迫切需要引進新的思路和技術。開發山楂果實高價值轉化利用的新技術也是目前山楂栽培與加工領域的一項重要課題。在山楂精深加工利用研究項目中,首先著眼于山楂果實中含量豐富的果膠,以此為切入點來尋找山楂果實高度利用的新途徑。在此,我們對14種山楂進行篩選對比,為防止本研究因品種差異導致的結果偏差過大,從而選擇7種理化性質相近的山楂品種,在分析篩選出來的山楂果膠理化性質的基礎上,進一步研究其抗氧化活性,以期拓寬山楂果膠的應用范圍,為今后利用山楂果膠開發保健食品和藥品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山楂共14種,品種:‘瑞豐’,‘燕瓤紅’,‘承德1號’,‘山東菏澤’,‘紫肉’,‘面楂’,‘大旺’,‘大金星’,‘歪把紅’,‘25號’,‘敞口’,‘大紅’,‘紫珍珠’,‘279’ 2016年9月采摘自學校山楂培育基地和承德興隆山楂產地;無水乙醇、鹽酸、硫酸、丙酮、硫酸 分析純,天津市風帆化學試劑有限公司;總抗氧化能力試劑盒(T-AOC) 南京建成生物工程研究所;蒽酮 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 分析純,華昌化工有限公司;咔唑 分析純,天津市光復精細化工研究所。

SHA-CA水浴恒溫振蕩儀、數顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司;TDZ5-WS離心機 長沙市湘儀離心機儀器有限公司;FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;U2910可見分光光度計 日本日立株式會社;HPLC1200高效液相色譜儀 安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠的制備 參照詹歌等[7]方法并稍作修改,將14種山楂清洗去皮去核稱重(m1)打漿,以1∶20 g/mL的料液比加入濃度0.81 mol/mL的鹽酸溶液,在80 ℃條件下提取90 min。提取液經4000 r/min離心10 min,棄去殘渣,4倍體積無水乙醇沉淀,過濾,經-55 ℃冷凍干燥9 h,制得果膠并稱重(m2)。

得率(%)=m2/m1×100

式(1)

1.2.2 果膠純度的測定 由于果膠的主要成分為半乳糖醛酸,因此以半乳糖醛酸含量代替果膠純度。冰水浴中10、20、30、40、50、60 μg/mL半乳糖醛酸溶液各1 mL,蒸餾水作為空白對照,加入10 mL濃硫酸,混勻,85 ℃反應25 min,冷卻至室溫,加入0.8 mL 0.15%咔唑無水乙醇溶液,在525 nm處測定其吸光值[8-9]。以標準溶液半乳糖醛酸含量(mg)對所測的吸光值(A)制作標準曲線,計算回歸方程為:y=0.0101x+0.1214,決定系數R2=0.9985。

稱取山楂果膠樣品5 g,冰水浴加入1 mol/L H2SO4溶液10 mL,85 ℃水解反應25 min,冷卻至室溫,蒸餾水定容至50 mL即得樣品溶液。取樣品溶液10 mL，蒸餾水定容至50 mL,移取稀釋后溶液1 mL，按照標準曲線法測定吸光值,按照回歸方程計算半乳糖醛酸含量。

1.2.3 果膠持油力的測定 稱量干燥后的離心管(m),稱取0.1000 g(m1)果膠樣品于離心管中,加入5 mL食用油,每隔5 min攪拌一次,30 min后,在3500 r/min條件下離心20 min,立即去除上清液,擦干管內外壁附著的油脂,稱重(m2)。

持油力(g/g)=(m2-m)/m1

式(2)

1.2.4 果膠總糖含量的測定 配制0.5 mg/L的葡萄糖標準溶液,稱取0.1 g蒽酮溶于100 mL 72%的濃硫酸中,置于棕色瓶中;吸取系列標準溶液、樣品溶液(采用1.2.1的制備方法得到的粗提液)和蒸餾水各2 mL分別放入8支具塞比色管中,沿管壁緩緩加入10 mL蒽酮試劑,立即搖勻,在沸水浴中加熱10 min,取出迅速冷卻至25 ℃,避光放置10 min,在620 nm波長下測定吸光度,繪制標準曲線:y=0.157x-1.121,R2=0.999[10]。

總糖含量(%)=C×B×10-4

式(3)

其中,C為從標準曲線查得糖濃度%;B為稀釋倍數。

1.2.5 果膠單糖構成分析

1.2.5.1 標準單糖溶液配制 分別配制5 mmol/L的D-木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、葡糖醛酸、和半乳糖醛酸溶液。

1.2.5.2 單糖衍生化 取1 mL單糖標準溶液，分別加入0.5 mol/L PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)和0.3 mol/L NaOH各1 mL,于70 ℃衍生30 min。冷卻10 min后加1 mL 0.3 mol/L的HCl進行中和,最后用氯仿將其萃取至無色,棄下層,保留上清，轉移至進樣瓶中備用。

1.2.5.3 山楂果膠樣品前處理 取干燥的果膠粉末20 mg,加入2 mol/L三氟乙酸2 mL,混勻后在120 ℃水解2 h,冷卻待用,用0.3 mol/L NaOH調pH7.0,定容至100 mL,于5000 r/min離心5 min,棄去下層,上清液預處理過程同標準單糖衍生化過程。

1.2.5.4 液相色譜條件 采用Agilent Technologies高效液相色譜系統;色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18-(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:A:PBS(0.01 mol/L,pH7.3),B:乙腈;洗脫程序如下進行:0～5 min,10%～15%(B);5～10 min,15%～20%(B);10～15 min,20%～22%(B);15～30 min,22%～30%(B);流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測溫度:35 ℃;波長:250 nm。

1.2.6 果膠甲氧基、酯化度、果膠酸的測定

1.2.6.1 樣品預處理 稱取處理后的果膠0.5 g,加入質量分數60%的酸性乙醇(加入1% HCl)50 mL，混合攪拌10 min,進行過濾,再用質量分數60%的酸性乙醇進行洗滌,次數為6次,后用60%乙醇洗滌,直到濾液不再出現紅色為止,最后用20 mL 95%乙醇洗滌,抽濾,105 ℃干燥備用。

1.2.6.2 甲氧基測定 稱取0.05 g經過預處理的樣品,用滴定法滴定,滴定過程中每消耗1 mL濃度0.5 mol/L NaOH相當于15.52 mg CH3O-,計算果膠甲氧基質量分數,然后按下面的公式計算酯化度(%)[11]。

酯化度(%)=Z/(C+Z)×100

式(4)

式中，Z為終點滴定值(mL),C為初始滴定值(mL)。

1.2.6.3 果膠酸的測定 采用起始滴定和皂化滴定的方法,稱取0.5 g樣品,用0.5 mol/L的NaOH溶液滴定,每1 mL濃度0.5 mol/L NaOH,相當于97.07 mg果膠酸,計算果膠酸的質量分數[11]。

1.2.7 抗氧化能力的測定 根據不同品種的山楂果膠的理化性質的比較,從中選擇了7種果膠進行了抗氧化能力的測定,分別為紫肉、紫珍珠、大金星、歪把紅、山東菏澤、279、25號。

1.2.7.1 總抗氧化能力的測定 總抗氧化能力(T-AOC)測定根據試劑盒說明書,按照標準操作,計算公式如下[12]:

總抗氧化能力=(C-D)/0.01/30((F/Q)(B(單位/mg)

式(5)

其中,C為測定OD值;D為對照OD值;F為反應液總量(mL);Q為取樣量(mg);B為樣品測試前稀釋倍數。

1.2.7.2 ABTS自由基清除能力測定 參照馬麗蘋[13]的方法,用PBS 緩沖液(pH7.4,0.2 mol/L)配制7.4 mmol/L的ABTS溶液即2,2′-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸),其中過硫酸鉀濃度為2.6 mmol/L,然后避光置于室溫下12～16 h,使用之前用PBS稀釋至OD734 nm值為 0.7±0.02。將果膠樣品用PBS溶液配制成0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL,分別取0.2 mL各濃度樣品溶液與2 mL ABTS稀釋液混合,室溫避光反應20 min后,立即在734 nm下測定吸光值,然后按下式計算ABTS自由基清除率[14],計算IC50值。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2/A0)]×100

式(6)

其中,A1為樣品溶液與ABTS稀釋液的吸光值,A2為樣品溶液與PBS緩沖液的吸光值,A0為ABTS稀釋液與PBS緩沖液的吸光值。

半數抑制率(IC50)的計算:以樣品的濃度對自由基清除率或吸光值作圖并進行線性擬合,計算IC50值,IC50值定義為吸光值為0.5時樣品的濃度[15]。

1.3 統計分析

2 結果與分析

2.1 酸提果膠的理化性質

由表1可以看出,酸提果膠得率位于0.71%～4.11%之間,其中大旺品種果膠得率最高，為4.11%,大紅品種最低。大金星品種果膠得率不高,但純度較高,為64.68%。劉曉莉等[16]采用酸提法提取山楂粉果膠,果膠得率為4.7%,而本文是對新鮮山楂進行提取的,因此得率與此研究有差異。原因可能是提取條件不同和品種之間的差異;大部分品種的山楂果膠持油力低于10 g/g,個別果膠持油力超過10 g/g,分別為瑞豐(10.01 g/g),大金星(10.93 g/g),敞口(10.13 g/g),紫珍珠(11.97 g/g)。張顏等[17]研究短枝六道木葉果膠的持油力為1.98 g/g,顯著低于山楂果膠(p<0.05)。

表1 酸提果膠的理化性質Table 1 Physicochemical properties of acid extract

山楂果膠具有較強的水溶性[17],說明果膠分子之間、果膠分子與水分子之間結合力較強。山楂果膠持油力較強,其原因可能是其對油脂有較強的吸附能力[18];酸提果膠除大紅(19.05%)和大旺(50.20%)外,其他果膠總糖含量均在20%～32%之間。

2.2 山楂果膠單糖構成結果分析

選取半乳糖醛酸含量在50%以上的9個品種，用高效液相色譜法對山楂果膠進行單糖成分分析。圖1A為大金星山楂果膠樣品糖成分分析圖譜。通過與標準圖譜進行對照,確定各峰的歸屬,可知,大金星山楂果膠由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸六種單糖組成,各組分的物質量比為2.96∶30.7∶3.2∶0.67∶56.61∶9.12。以半乳糖醛酸為最主要成分。馮靜研究的菠蘿皮果膠中含有較多的木糖,同時葡萄糖含量也較高[19],本研究中,葡萄糖含量較低。這可能是由于不同種屬植物其細胞壁多糖構成不同而引起的。

圖1 大金星山楂果膠中單糖HPLC和單糖標準譜圖Fig.1 HPLC spectra of monosaccharide in dajinxing hawthorn pectin and standard monosaccharide注:1.葡萄糖;2.鼠李糖;3.阿拉伯糖;4.半乳糖醛酸;5.半乳糖;6.木糖;7.葡萄糖醛酸。A為單糖標準圖譜,用于定性分析;B為山楂果膠單糖圖譜。

表2為9種不同品種山楂果膠中單糖物質量比。其中歪把紅、大旺、279三種山楂果膠中有木糖,其摩爾含量分別為3.96%、7.84%和2.84%。其中大金星山楂半乳糖醛酸含量最高。

表2 不同品種山楂果膠單糖構成比較Table 2 Comparison of monosaccharide composition in different varieties of hawthorn

蘋果果膠由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖六種單糖組成,各組分的含量物質量比為0.612∶2.535∶2.311∶4.785∶78.54∶0.943[20];柑橘果膠由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖六種單糖組成,各組分的含量物質量比為8.04∶29.77∶16.83∶1∶43.09∶1.27[19];甘薯果膠由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、木糖六種單糖組成,各組分的含量物質量比為7.38∶1.23∶9.48∶1.47∶79.23∶3.76∶3.74[21]。本研究結果表明,大金星山楂果膠半乳糖醛酸含量為56.61%,高于柑橘果膠,低于蘋果和甘薯果膠。蘋果果膠的半乳糖醛酸含量相較于其他三種最高,并且與柑橘果膠含有相同種類的單糖組分。甘薯果膠半乳糖醛酸含量為79.23%,中性糖含量為23.3%。可見雖然同是果膠,不同原料提取出的果膠，其單糖構成并不完全相同。

2.3 不同品種山楂的甲氧基、酯化度及果膠酸含量

高甲氧基果膠和低甲氧基果膠是按照酯化度或甲氧基含量的不同來分類,甲氧基質量分數大于7.0%;小于16.32%的果膠為高甲氧基果膠,而甲氧基含量<7.0%的果膠稱為低甲氧基果膠[22]。從表3可以看出,山楂果膠均為高甲氧基果膠,質量分數均在8%～11%。不同品種的山楂果膠酯化度沒有顯著差異(p>0.05)。紫珍珠品種果膠酸含量最高達87.64%,高于最低品種燕瓤紅含量的15.81%。

表3 甲氧基、酯化度及果膠酸含量Table 3 Methoxy,esterification and pectic acid content

2.4 抗氧化能力

由圖2和圖3可以看出,山楂果膠具有良好的抗氧化性。其中大金星與歪把紅最高,均高于80(unit/mg),顯著高于其他品種(p<0.05);279號,紫肉與25號抗氧化性相對較高;紫珍珠總抗氧化能力最低;不同品種山楂所得到的果膠抗氧化能力有顯著差異,最高品種是最低品種抗氧化能力的2.64倍,建議選用抗氧化能力較強的山楂進行抗氧化性方面的研究。半數抑制濃度(IC50)指的是清除一半ABTS自由基時所消耗受試物的總量。作為評價抗氧化活性最常用參考指標,IC50值越小,表明該物質的抗氧化活性越強[23]。由圖3可知,歪把紅的IC50值最小，表明其對ABTS自由基清除能力最強;而紫珍珠最弱。由7種果膠的自由基清除能力可以看出,ABTS測定方法與總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒方法得到的結果一致。

圖2 總抗氧化能力測定結果Fig.2 Total antioxidant capacity determination results

圖3 ABTS自由基清除率Fig.3 ABTS free radical scavenging rate

3 結論

從本實驗采用酸法提取14種山楂果膠的結果來看,大旺品種果膠得率最高,為4.11%,大紅品種最低。酸提法的優點是耗時短、操作簡單且消耗藥品少,且得到的甲氧基質量分數都大于7.0%,小于16.32%,均為高甲氧基果膠,但酸提山楂得到的果膠純度不高,后續研究可進一步改進方法,提高果膠純度。大部分品種的山楂果膠持油力低于10 g/g,但大金星(10.93 g/g),敞口(10.13 g/g)、瑞豐(10.01 g/g)、紫珍珠(11.97 g/g)均高于其他品種。果膠總糖含量,除大紅(19.05%)和大旺(50.20%)外，其余均在20%～32%之間。山楂果膠具有較強的抗氧化能力,不同品種抗氧化能力差異顯著(p<0.05)。大金星、歪把紅等抗氧化能力較高,均高于80(unit/mg),顯著高于其他品種,本研究為山楂果膠的生物活性研究奠定了基礎,為進一步開發利用山楂提供理論依據。