新疆野生蘋果回交群體釀酒適宜性評價

左衛芳,許 琳,許海峰,陳學森

(山東農業大學作物生物學重點實驗室,山東泰安 271000)

新疆野蘋果屬第三紀孑遺物種[1],是我國經濟果樹資源中惟一的天然基因庫,變異的多樣性使新疆野蘋果引起越來越多研究者的關注[2]。但是由于人為破壞及病蟲危害,新疆野蘋果已被列入國家瀕危二級保護植物名單[3]。以往對新疆野蘋果的利用都是育種研究,而其果肉和果汁往往得不到充分利用。此外，由于新疆野蘋果不耐儲藏,基本沒人對其進行深加工利用,使新疆野蘋果的經濟效益不能充分體現出來[4]。課題組在過去的十年以新疆野生蘋果與紅富士和嘎啦等蘋果品種雜種后代分離群體為對象確定初選株系,對前期初選的株系進行嫁接,建立高接鑒定圃,通過對各參試株系果實大小與形狀、糖、酸、香味物質、類黃酮和礦質元素及硬、脆度等品質因素的檢測與評價,確定初選了品系，擬通過對初選品系的品種加工試驗等程序確定復選優系,為確定復選優系提供加工方面的科學依據。

蘋果酒作為世界第二大果酒,國內外學者在原料選擇、工藝優化[5]、酵母選擇[6]、降酸[7]、澄清及成分分析上做了大量工作和研究[8]。其中有研究表明糖、酸和酚類等是選擇蘋果釀酒專用品種的主要指標。理想的釀酒用蘋果汁要求含糖15%、蘋果酸0.4%、單寧0.2%[9]。而陳志娜等[10]研究發現新疆野生蘋果總多酚的平均值是蛇果果皮中的3倍左右。張小燕等[11]鑒定出新疆野蘋果總酚及主要多酚物質含量比栽培蘋果紅星高。課題組研究發現新疆野蘋果回交群體的可滴定酸在0.4%左右,某些株系總酚含量達到3857.27 mg·kg-1FW,6種礦質元素(鈣、鎂、鐵、銅和鋅)與栽培蘋果表現出較大差異,其中鈣的含量是栽培蘋果品種的3.1倍[12-14]。宋燁等[15]研究發現釀酒品種總酚含量變動于2524.8～3511.7 mg·kg-1FW 之間,兒茶素含量在300～600 mg·kg-1FW 之間。以上研究足以證明新疆野生蘋果存在加工釀酒的優良性狀,但是目前國內外還很少有關于新疆野生蘋果加工利用的報道。

本研究以新疆野生蘋果回交群體紅心系列蘋果的144個株系為研究對象,在對果實、果酒品質指標測定的基礎上,運用相關性分析、因子分析等方法綜合評價紅心系列蘋果釀酒適宜性。對新疆野蘋果回交群體造酒適宜性進行評價,篩選適宜于造酒的新疆野蘋果后代株系。通過對初選、復選、決選等程序,以期培育出果肉全紅、類黃酮含量高、易著色、營養保健價值大、鮮食品質優良或加工性能優異、能產業應用的高類黃酮蘋果新品種,實現新疆紅肉蘋果野生資源的“利用保存”。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果原料于2015年8月采收于聊城冠縣育種基地;釀酒酵母 安琪酵母股份有限公司;果膠酶 寧夏和氏璧生物技術有限公司;乳酸菌450Instant 煙臺LAFFORT;丙酮(分析純)、福林酚(FC試劑) 北京索萊寶科技有限公司;甲醇(分析純) 天津市永大化學試劑有限公司;TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪) 廣州偉伯科技有限公司;碳酸鈉、氯化鐵 天津市凱通化學試劑有限公司。

UV-2450紫外可見分光光度計 島津公司;RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;原子吸收光度計 北京仙能多儀器有限公司;釀酒所用設備 本實驗室自主發明設計的配套裝置,分別有行程式果蔬破碎打漿器[16]、控溫型釀造分餾器[17]、控溫型分離貯酒器[18]及冷凝烤酒器[19]。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒實驗 釀造工藝:清洗去雜→打漿→加果膠酶→加酵母→主發酵→陳釀。

發酵前處理:將一定質量m的每組蘋果經清洗后在發酵罐中進行破碎打漿,獲得蘋果果漿,稍作滅菌處理后,加入0.6%(m/m)果膠酶。酵母活化:從發酵罐的出酒口接一部分果汁出來,加入3%(m/m)的活性干酵母,活化4 h獲得活化酵母。酒精發酵:將活化好的酵母菌按照3%的比例添加到發酵罐中,于18 ℃條件下發酵,發酵液每日攪拌,保證發酵液均勻。并在發酵不同時間(2、4、6、8、10、12 d)取樣,12 d后所有酒樣糖度不變,停止發酵。將發酵液用4層紗布過濾后得到濾液于新發酵罐中,并于0～5 ℃陳釀。

1.2.2 指標測定 單果重用天平稱量,果實縱徑與橫徑用游標卡尺測量,可溶性固形物含量用手持糖量計測定,利用質構儀測定果實硬度和脆度[20];可溶性糖用蒽酮比色法測定[21];可滴定酸用酸堿中和法測定[22];果肉鈣、鎂、鐵含量用原子分光光度計測定[23]。所有指標測定均重復3次取平均值,計算標準差及變異系數。蘋果酒酒精度測定用酒精計測定,其余指標測定參考果肉指標測定,蘋果酒取樣后離心處理后即為提取液,各指標測定反應體系跟果肉指標測定相同。

1.2.3 總酚抗氧化能力測定 將果肉(去除果皮果心)用液氮研磨成粉,稱取10 g果粉,加入50 mL 80%的丙酮,4 ℃浸提24 h。總酚含量測定采用Waterhouse方法[24]略做修改。FD法將1 mL 樣品再加入1 mL福林酚(FD)試劑,加入2 mL 7.5% Na2CO3,6 mL蒸餾水反應30～60 min;FC法1 mL濾液加1 mL FC試劑,加入3 mL Na2CO3,5 mL蒸餾水反應30～60 min后765 nm測其吸光度,用沒食子酸為標品做標準曲線,Y=8.1722x-0.0344R2=0.9843;類黃酮含量測定參考Jia等[25]的方法,標準曲線為(Y=0.9166x+0.0047R2=0.9997);抗氧化能力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)測定采用Benzie和Strain[26]的方法,標準曲線為Y=49.305x-0.1671,R2=0.9996;花色苷用0.5%鹽酸甲醇提取,提取程序與前述提取酚類化合物一致,最后定容于10 mL試管。花青苷含量測定方法采用pH示差法[27]。

1.2.4 蘋果品種釀酒適宜性評價方法 采用Excel數據分析軟件進行簡單分析,并用SPSS軟件進行因子分析、判別分析等。利用DPS數據處理系統把確定的蘋果釀酒適宜性評價指標劃分為低、中、高3級,分級結果用χ2法檢驗是否服從正態分布。蘋果品種釀酒適宜性從營養品質、風味品質和加工品質(可溶性固形物、可滴定酸、類黃酮和總酚)3個方面加以評價。用9級標度法構造層次結構關系,運用層次分析確定各指標的權重。用標準化轉換后各評價指標的數值乘以各評價指標的權重得各品種綜合得分,用聚類分析將144個品種按綜合得分由高到低劃分為3類,3類品種的釀酒適宜性依次為適宜、較適宜和不適宜。

從3類品種中各抽取三分之二的品種(共96個品種)組成建模樣本,剩下48個品種為檢驗樣本進行判別分析[28],建立判別函數;用檢驗樣本檢驗判別函數的判別準確性。進行蘋果品種釀酒適宜性判別時,該品種各釀酒適宜性評價指標的得分根據評分標準確定并一一代入判別函數,計算相應判別函數的函數值,其函數值與哪一類組質心函數值最接近,即被判為該類品種。在對果實理化指標測定基礎上,運用相關統計分析處理將采回的蘋果分適宜、較適宜、不適宜3類分別做釀酒實驗。

1.2.5 蘋果酒感官評定方法 由20～60歲之間的20人(包括專家3人,食品專業背景博士4人,碩士10人,男女比例1∶1)組成感官評定小組,對他們進行相關培訓。按照蘋果酒感官評定原則(參考葡萄酒感官分析標準GB/T15038-2006制定)對三類蘋果酒進行感官評定，感官評定標準如表1所示。

表1 蘋果酒感官評定標準Table 1 Cider sensory evaluation standard

2 結果與分析

2.1 蘋果果實品質指標分析

當度量單位或平均數不同時,只能用變異系數表示離散程度,因此本文的離散度用變異系數表征。紅心系列蘋果不同品系類黃酮含量、總酚含量、花青苷和固酸比離散度大(離散度越大表示紅心系列蘋果株系間差異越大),變異系數(coefficient of variation,CV)均在60%以上;果實可溶性糖變異系數為26%,可溶性固形物、脆度變異系數在20% 以下(表2),證明離散度較小。蘋果酒類黃酮、總酚含量離散度比較大,均在90%以上,鈣、鎂、可滴定酸離散度較小,其中可滴定酸的離散度最小(5.3%)。

表2 蘋果果實品質指標水平Table 2 Level of quality indices of apple fruit

2.2 蘋果果實和蘋果酒品質指標相關性分析及評價指標的確定

根據果實與蘋果酒品質相關性及總酚含量對果汁品質的影響,將可滴定酸、可溶性固形物、總酚、類黃酮、可溶性糖、固酸比、蘋果酸和花青苷8項納入蘋果品種釀酒適宜性評價指標考察范圍。因子分析顯示,前4個因子的特征值(eigenvalue,Ei)均大于1為主因子,方差貢獻率(percent of variance,POV)之和為89.56%,即前4個因子所包含的信息量占總信息量的89.56%(表3)。第1主因子的代表指標為可滴定酸、固酸比,這些指標主要影響蘋果酒的風味,因此把它定義為風味因子。第2主因子的代表性指標為總酚,酚類物質與蘋果酒褐變有很大關系,褐變直接影響蘋果酒色澤,因此定義為色澤因子。第3主因子的代表性指標為可溶性固形物和可溶性糖,這些指標與蘋果酒酒精度有直接關系,定義為營養因子。第4主因子的代表性指標為類黃酮含量,蘋果中類黃酮成分大多具有保健價值,定義為功能因子。在風味因子的2項代表性指標中及營養因子的2 項代表性指標中,可滴定酸和可溶性固形物因子權重比較大。最終確定果實可溶性固形物、可滴定酸、類黃酮、總酚4項指標為蘋果釀酒宜性評價指標。

表3 成分得分系數矩陣Table 3 Component score coefficient matrix

2.3 蘋果品種釀酒適宜性評價指標分級標準的建立

果實可溶性固形物、可滴定酸、總酚、類黃酮等4項指標的分級標準(grading standard,GS)和各級的品種比例(cultivar percentage,CP)詳見表4。χ2檢驗的結果表明可溶性固形物、可滴定酸、總酚和類黃酮4項指標的分級均服從正態分布,概率值分別為0.09、0.11、0.48和0.14。由表4可見,各等級的品種分布比例存在差異。可溶性固形物含量中等的品種最多,占56.25%;可溶性固形物含量低的品種占6.25%;可溶性固形物含量高的品種占37.50%左右。可滴定酸中等的品種最多,占75.00%;可滴定酸量低和高的品種所占比例相等,二者共占25.00%。總酚含量低的品種最多(占58.80%),總酚含量中等的品種次之(占23.60%),高低含量二者共占76.90%;總酚含量高的品種占比例不足20.00%。類黃酮含量低的品種比例占31.25%;類黃酮含量中等的品種占37.50%;類黃酮含量高的品種較少(占31.25%)。

表4 蘋果品種釀酒適宜性評價指標分級標準Table 4 Classification standard for suitability evaluation index of apple varieties brewing

2.4 蘋果品種釀酒適宜性評價指標評分標準建立

經層次分析確定可溶性固形物含量的權重為0.25,可滴定酸的權重為0.24,總酚的權重為0.15,類黃酮含量的權重為0.35。以4項指標的權重乘以100為各指標的滿分值,并以滿分值的10%為級差。以可溶性固形物含量、類黃酮含量(暫列為正向指標)最高等級的得分為滿分,其前各等級的得分依次遞減。以可滴定酸、總酚中等(暫列為中性指標)的得分為滿分,兩邊各等級分數依次減少;4項指標的評分標準詳見表5。

表5 蘋果品種釀酒適宜性評價指標評分標準Table 5 Evaluation standard of suitability evaluation index of apple varieties brewing

2.5 蘋果品種釀酒適宜性判別函數的建立

判別分析得到2個判別函數:

y1=0.171x1-1.483x2+0.028x3+3.04x4-5.047

y2=4.176x1+5.32x2-0.202x3+0.106x4-2.213

式中,x1～x4分別代表可滴定酸、可溶性固形物、類黃酮、總酚4項蘋果品種鮮榨汁加工適宜性評價指標的得分。y1～y2分別代表判別函數的判別值。用上述判別函數對建模樣本(96個品種)進行判別,由第1類判為第2類有9個,判對的概率為92.35%。用上述判別函數對檢驗樣本(48個品種)進行判別,有3個品種由第2類判為第1類,判對的概率為93.41%。從圖1可直觀地看出,釀酒適宜性不同的3類蘋果品種能很好地被分開。144個蘋果品種的釀酒適宜性評價結果表明,不適宜的品種占32.14%,較適宜的品種占51.40%,適宜的品種占18.75%。釀酒適宜的品種共計27個,理化指標如表6所示。

表6 野生蘋果回交群體釀酒適宜品種部分理化指標Table 6 Some physical and chemical indexes of suitable brewery varieties for backcross population of wild apples

圖1 典則判別函數Fig.1 Canonical discriminant function注:1:不適宜;2:較適宜;3:適宜(分類依據如上文1.2.4述);函數1、2分別代表判別函數1、2。

2.6 三類蘋果酒感官比較

感官分析結果見表7,從表中可以看出按上述分類方法所分的3類蘋果酒的色澤與風味存在差異,而香氣基本沒有差異。這與各類蘋果之間有機酸、類黃酮及酚酸等存在差異有直接關系。

表7 3類蘋果酒感官評定結果Table 7 Sensory evaluation results of three kinds of apple wine

3 討論

雖然所有品種的蘋果都可用來釀造蘋果酒,但相比較而言釀酒專用品種釀造的蘋果酒品質要高于普通蘋果酒,蘋果酒的風味和品質取決于其糖、酒度、酸、酚類、香氣等物質的種類和含量[9]。其中香氣成分和酚類物質是影響質量和典型性的主要物質,酚類物質還被許多學者稱作是果酒的功能成分[29]。多酚物質是酚類物質的總稱,包括小分子酚類物質和單寧。Spallos將蘋果酒中的小分子酚類物質分為兩大類:酚酸及其衍生物(稱之為酸性酚)和類黃酮類物質(稱之為中性酚),這兩類酚類與單寧一起構成蘋果酒中酚類物質的主體[30]。而本研究也發現新疆野生蘋果回交群體中61%的株系蘋果酸在0.4%左右,小分子酚類物質含量相當豐富,有望篩選出用于加工釀酒的好材料。篩選培育適宜深加工的蘋果品種,建立蘋果加工基地不僅可以推動蘋果加工產業的發展,而且可以提升蘋果產業水平,同時還可以推動農業產業結構調整[31]。

紅酒具有一定抗氧化及抗炎功能得益于酚類物質[32-34],有報道說葡萄酒酚類物質可以誘導內皮一氧化氮依賴性血管舒張,抑制低密度脂蛋白氧化和血小板聚集[35-38]。也有學者對葡萄酒酚類物質的抗癌活性進行了論證[39]。紅葡萄酒的酚類物質和黃酮類化合物具有治療潛力,這就促使研究人員去探索其他具有比葡萄酚含量高的水果的潛在用途,以用來生產保健酒。而蘋果酚類物質中原花青素抗氧化能力很強,根皮苷是蘋果特征酚類物質,它對糖尿病及其并發癥有良好的防治作用[40],王培義等[41]研究表明蘆丁、槲皮素、異槲皮素等還具有消腫、軟化組織及抗菌消炎的作用。另外黃酮類化合物的藥理功能還有抗氧化、抗癌、降血糖、降血壓等。不僅如此,多酚含量高的蘋果品種抗逆性強。酚類物質在植物抗逆反應中的作用也很重要,植物對生物及非生物脅迫的抗性都與酚類物質密切相關,一些植物感病后所產生的次生物質主要也是多酚化合物,在高粱、燕麥、擬南芥上也都有類似的報道提出酚類物質可能是植物抗性的主要貢獻因子[42-44]。因此從以上幾個方面考慮,酚類含量高的新疆野蘋果對選育果樹新品種、提高果實品質以及功能性食品(蘋果酒等)開發等都具有重要價值。本研究在建立蘋果品種釀酒適宜性評價指標時,將可溶性固形物含量和可滴定酸定性、總酚、類黃酮確定為蘋果釀酒適宜性的主因子原因就在于此。

生產者選擇加工蘋果酒的蘋果品種時,會考慮其加工適宜性、果品耐貯性、豐產性及抗病蟲能力等因素。豐產性是最先考慮的因素[45],種植不豐產的品種難以保證產量及經濟效益。尤其是加工用蘋果售價普遍較鮮食蘋果低的情況下,更應該考慮蘋果品種的豐產性。蘋果銷售有很強的季節性,導致蘋果酒生產也有很強的季節性。如果原料果耐貯性差,采購后必須盡快加工,往往會造成原料采收期人力、物力緊張,原料采收期之后設備閑置的局面。如果原料果耐貯,便可以大量購買和貯存,繼而分批次陸續釀酒,緩解加工壓力[46]。另外抗病蟲能力強的品種對蘋果酒生產更有利,不僅可以減少農藥使用、節約生產成本,還能降低農藥殘留。新疆野蘋果回交群體遺傳多樣性豐富、小分子酚類物質含量高,一方面可能是通過基因調節而產生的適應外界環境的表現;另一方面可能因為基因型差異導致新疆野蘋果的抗逆性差異,回交群體中不乏有抗逆性強的優異單株,這不僅可以改善現有蘋果品種抗性減退現象,還可以解決栽培蘋果遺傳基礎狹窄問題,同時還可以實現對新疆野蘋果“利用保存”。本研究篩選出的優良株系結合寬行高干配套高效栽培技術[47],大多豐產還兼具耐貯或抗病(蟲)的優點。

4 結論

本實驗研究了野生蘋果回交群體144個株系的可滴定酸、總糖、可溶性固形物、總多酚、總黃酮、抗氧化活性及礦質元素。發現紅心系列蘋果不同株系的總多酚、總黃酮及抗氧化活性之間具有顯著地差異。通過因子分析、層次分析、聚類分析、判別分析建立了蘋果品種釀酒適宜性評價技術,并發現在紅心系列蘋果(尚未正式命名,“紅心系列蘋果”為內部叫法)的144個株系中有27個株系適宜釀酒,有73個株系較適宜釀酒,有44個株系不適宜釀酒。