關鍵環境因子對螺旋藻營養元素生物積累及有機化程度的影響

呂冰心,徐青艷,常 蓉,顏志秀,李博生

(北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系,林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京林業大學螺旋藻研究所,北京 100083)

螺旋藻(Spirulinaplatensis)是一種絲狀藍藻,其營養物質豐富,作為食物具有悠久的歷史[1]。螺旋藻中蛋白質約占60%～70%,且含有豐富的碳水化合物、β-胡蘿卜素及礦物質等營養物質,因而被世界衛生組織(WHO)譽為“人類21世紀的最佳保健品”[2]。工業化生產的螺旋藻,已廣泛應用于食品保健、醫藥、化妝品和水產飼料等行業中[3-5]。

近年來,礦物質元素缺乏成為大家普遍關注的問題。根據第三次全國營養調查數據顯示,我國人民的鈣攝入水平只達到適宜攝入量(Adequate intakes,AI)的20%～50%,硒攝入量僅達到世界衛生組織推薦最低標準的72%,而缺鐵性貧血率仍平均為20%左右,而在中國少年兒童中,缺鋅率高達60%[6]。已有大量的研究表明螺旋藻能夠通過大分子的吸附作用、與蛋白質和脂類等大分子結合作用以及螯合等不同的方式對不同的金屬離子進行有效的富集而極易被人體消化吸收,轉化利用率較高[7-10]。因此,利用螺旋藻的優勢開發礦質元素高富集產品及相應的食品添加將對改善我國人民礦物質元素缺乏及螺旋藻產業化開發有重要意義及深遠影響。在實際生產過程中,環境因子(溫度、光照、pH)對螺旋藻生長量及其對礦物質富集作用具有重要的影響[11-13]。因此,本項研究突破了只通過增加螺旋藻外源培養液離子濃度達到細胞積累礦物質營養元素的方法,探討通過調控主要環境因子(光照、溫度、pH)的交互作用對其生長和元素積累的影響,同時配合外源離子濃度雙重調控作用。在獲得螺旋藻較高生物量的同時,達到螺旋藻最大化富集礦物質營養的目的,從而獲得不同礦物質營養元素的高富集螺旋藻。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鈍頂螺旋藻 北京林業大學螺旋藻研究所。培養液為Zarrouk(簡稱為Z氏)培養液,成分如表1,表2;硫酸銨、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、碳酸鈣、亞硒酸鈉、七水合硫酸亞鐵、硫酸鋅、冰醋酸等均為分析純 西隴化工股份有限公司。

表1 Zarrouk培養液組成成分Table 1 Compositions of Zarrouk medium

表2 Zarrouk微量元素溶液組成成分Table 2 Compositions of the microelement of Zarrouk medium

721型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;FD-I冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司;人工氣候室 德國;ICPS-7000等離子體原子發射分光光度計 北京華科易通分析儀器有限公司;900Z原子吸收光譜儀、Optima700電感耦合等離子光譜發生儀 美國PE 公司;GTR10-1冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司;XO-1000D超聲波細胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司;WSJB-04電磁攪拌器 河南中良科學儀器有限公司;DK-SD電熱恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;KDN-12C控溫消煮爐 上海企戈實業有限公司;MD1470透析袋(8000～14000 Da) 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 螺旋藻接種及培養方法 選擇對數生長期的螺旋藻,在Z氏培養液中培養,光暗比為12∶12。用紗布過濾除去死藻及結塊的藻,取濾液,用300目生物網再次過濾,藻細胞用Z氏培養液沖洗三次后收集濾干。接種于500 mL錐形瓶中,接種量為OD560=0.3,每瓶加入300 mL Z氏培養液,置于恒溫搖床培養(溫度30 ℃,轉速120 r/min)。在一定溫度、光照、pH條件下培養7 d后收獲,用300目生物網過濾,過濾得到的藻細胞用蒸餾水清洗至pH=7后置于冷凍干燥機(溫度-76 ℃,時間24 h)中凍干,得螺旋藻干粉。

1.2.2 螺旋藻生長速率測定 將螺旋藻培養液充分搖勻,用紫外可見分光光度計,在波長為560 nm處測定藻液吸光度值,每天進行測定,平行三次,連續測7 d。螺旋藻生長速率公式如下:

式(1)

式中,K為生長速率,N表示培養t天的OD560值,N0表示初始OD560,t為培養天數,d[14]。

1.2.3 正交試驗設計 鈍頂螺旋藻的最適生長范圍為溫度20～40 ℃、光照4～12 kLux、pH在8.5～10.5[7,17]。本實驗對溫度、光照和pH三個環境因素進行單因素實驗后進行三因素三水平正交試驗,探究外界環境對螺旋藻生長及幾種營養元素積累的交叉作用。正交試驗設計表如下:

表3 正交實驗因素水平表L9(34)Table 3 Orthogonal experimental factors and levels L9(34)

1.2.4 螺旋藻礦物質營養元素積累隨時間變化規律 以Z氏培養基為基礎,在最佳生長量條件:光照12 kLux,溫度30 ℃,pH9.5培養3 d達到對數生長期后,第4 d調整環境條件,同時在培養液中加入CaCO30.6 g/L、FeSO4·7H2O 40 mg/L、ZnSO4·7H2O 40 mg/L、Na2SeO3100 mg/L[7,17-19],以Z氏培養液為對照,每組設置三個平行,連續培養,每天對生長量進行測定,其中鈣富集培養條件為:溫度20 ℃,光照12 kLux,pH8.5;鐵富集培養條件為:溫度30 ℃,光照4 kLux,pH10.5;鋅富集培養條件為:溫度30 ℃,光照8 kLux,pH8.5;硒富集培養條件同對照。分別在第3、5、7、9 d(鈣)結束時取樣,收集各條件下富營養元素的藻細胞,凍干(溫度-76 ℃,時間24 h),測定其中微量元素含量。

1.2.5 富礦物質元素螺旋藻樣品收集

1.2.5.1 富鈣螺旋藻樣品收集 富鈣螺旋藻培養一定天數后,用300生物網過濾得到藻細胞,用0.1 mol/L醋酸沖洗數次,再用蒸餾水沖洗至pH為7[20]。收獲,凍干(溫度-76 ℃,時間24 h),測定螺旋藻細胞內鈣元素含量。

1.2.5.2 富鐵、富鋅、富硒螺旋藻樣品收集 富鐵、鋅、硒螺旋藻培養一定天數后,用300目生物網過濾得到藻細胞,用蒸餾水清洗至pH為7,收獲,凍干(溫度-76 ℃,時間24 h),測定螺旋藻細胞內鐵、鋅、硒元素含量。

1.2.6 螺旋藻礦物質含量測定 稱取0.2 g培養后收集的藻粉,加入混酸HNO3∶HClO4(5∶1)30 mL,錐形瓶頂部蓋漏斗,輕輕緩慢搖勻之后在控溫消煮爐上進行消化,隨著消解作用加強,錐形瓶內產生黃煙,待黃煙散盡瓶內出現白色煙霧裝氣體,消化結束。冷卻后過濾,用去離子水定容至100 mL,待測。其中鈣元素含量測定需要從定容后的100 mL樣液中取2 mL,加入1 mL硝酸鑭,定容至50 mL,待測。鈣元素、鐵元素、鋅元素采用原子吸收光譜儀測定[21];硒元素采用電感耦合等離子光譜發生儀測定[22]。

1.2.7 有機化程度測定

1.2.7.1 螺旋藻藻粉總礦物元素含量測定 螺旋藻藻粉總礦物元素含量測定方法同1.2.6。

1.2.7.2 螺旋藻藻粉無機化礦物元素測定 稱取0.2 g培養后收集的藻粉,用離子水混合均勻后在超聲破碎儀上破碎30×5 s(間歇5 s),取上清液在4 ℃冷凍離心,離心條件為:8000 r/min、15 min,收集上清液過濾,定容至10 mL,用原子吸收光譜儀檢測鐵、鋅元素含量,硒元素含量用電感耦合等離子光譜發生儀檢測。鈣元素含量測定需要從定容后的100 mL樣液取2 mL,加入1 mL硝酸鑭,定容至50 mL,用原子吸收光譜儀進行測定。

1.2.7.3 螺旋藻藻粉有機化程度 藻粉內各元素與螺旋藻細胞內物質的有機化結合量用總量與無機含量之差表示:

式(2)

式中:M1為藻粉總礦物質元素含量;M2為藻粉無機化總礦物質元素含量。

1.2.8 螺旋藻蛋白質提取及礦物質含量測定 稱取一定量富礦物質螺旋藻粉,加入蒸餾水混合(過0.45 μm水系微濾膜)以1∶20比例配制成懸浮液,置于4 ℃條件下浸泡過夜。將浸泡后的懸浮液置于-18 ℃的冰箱中反復凍融三次,然后在400 W功率下進行超聲破碎15×3 s(停3 s)后,置于4 ℃冷凍離心,離心條件為:8000 r/min、15 min。用50%的飽和硫酸銨對離心后的上清液進行鹽析,鹽析后冷凍離心,離心條件為:4 ℃、6000 r/min、20 min,收集沉淀;用濃度為0.005 mol/L,pH6.86的PBS溶液溶解沉淀后裝于8000～14000 Da透析袋中冷藏透析,透析終點用氯化鋇進行檢測[23]。脫鹽后用冷凍干燥機進行冷凍干燥(溫度-76 ℃,時間24 h),得富礦物質螺旋藻粗蛋白,分別用原子吸收光譜儀和電感耦合等離子光譜發生儀對鈣、鐵、鋅、硒元素含量進行檢測。

1.2.9 螺旋藻蛋白質含量測定 凱氏定氮法(GB5009.5-2010)。

1.2.10 紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法將富礦物質螺旋藻樣品進行處理,經過紅外掃描得到紅外吸收光譜圖[24]。

1.3 數據處理

本實驗數據采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件及Excel 2010進行處理。

2 結果與分析

2.1 溫度、光照、pH對螺旋藻生長及營養元素積累的影響

2.1.1 吸光度值與生物量之間的關系曲線 表示螺旋藻生長量的方法通常有兩種,一種為連續測定螺旋藻的OD560值,另一種是測定螺旋藻細胞的干重,通過實驗探究兩者之間的關系,觀察其在螺旋藻生物量表達上是否呈現一致性[25],其結果如圖1所示。

圖1 鈍頂螺旋藻生物量干重與OD560相關性Fig.1 Relationship between Spirulina platensis dry cell weight and OD560

由圖1知,在一定范圍內,鈍頂螺旋藻細胞干重與其OD560值之間具有較好的線性關系。回歸方程y=0.5126x-0.0413,其中x為560 nm處OD值,Y為凍干后的螺旋藻細胞干重,相關系數R2=0.9954。因此可用OD560表示螺旋藻生物量變化規律,并可根據回歸方程公式進行互換。

2.1.2 溫度、光照、pH對螺旋藻生長速率及鈣、鐵、鋅元素積累的影響 由表4中k值分析可知,鈍頂螺旋藻最佳生長速率條件為:A2B3C2,即溫度30 ℃,光照12 kLux,pH9.5。由極差分析可以看出:RB>RA>RC,三個主要環境因素對鈍頂螺旋藻生長速率的影響依次是:光照>溫度>pH,即光照對螺旋藻生長量影響最大。

表4 生長速率及鈣、鐵、鋅積累正交實驗結果與極差分析Table 4 Orthogonal experiment and range analysis of growth rate,calcium,iron and zinc accumulation

由表4中極差分析可見,有利于鈣積累的最佳環境條件為A1B3C1,即溫度20 ℃,光照12 kLux,pH8.5。影響鈣元素積累的環境因素主次順序為:RA>RB>RC,即溫度>光照>pH,溫度對鈍頂螺旋藻鈣積累影響最大。有利于鐵積總累的最佳環境條件為A2B1C3,即溫度30 ℃,光照4 kLux,pH10.5。由極差分析可知,三個環境因素對螺旋藻鐵富集的影響主次順序為:RB>RC>RA,即光照>pH>溫度,光照對鐵積累影響最大。有利于鋅積總累的最佳環境條件為A2B2C1,即溫度30 ℃,光照8 kLux,pH8.5。由極差分析可知,三個環境因素對螺旋藻鐵富集的影響主次順序為:RC>RA>RB,即pH>溫度>光照,pH對鋅積累影響最大。

2.2 外源礦物質添加對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.1 鈣對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.1.1 不同鈣富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同鈣富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響如圖2所示。

圖2 鈣富集時間對螺旋藻生長的影響Fig.2 Effect of different calcium accumulation time on the growth of Spirulina

由圖2可見,對照組與實驗組螺旋藻生長量隨時間延長均呈線性增加關系。在生長前期和中期實驗組與對照組生長量差異(p<0.05)不明顯,生長末期從第7 d開始實驗組相對生長量略低于對照組,至培養周期結束第9 d收獲時,實驗組生長量相比于對照組降低了2.5%。

2.2.1.2 螺旋藻富集鈣元素含量隨培養時間變化規律 通過上述實驗獲得富鈣螺旋藻,分別于初始、第3、5、7、9 d進行鈣元素含量及有機化測定,其結果如圖3所示。

圖3 螺旋藻培養過程中鈣元素含量及有機化程度變化Fig.3 Calcium accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

由圖3可見,在整個培養周期內,鈍頂螺旋藻鈣元素富集總量呈上升趨勢,第5 d比第3 d鈣含量增加了1.24倍,第7 d比第5 d鈣含量增加了2.23倍,在培養的第9 d達到最大值18.62 mg/g。螺旋藻鈣元素有機化程度呈先上升后平穩的趨勢,在第7 d時,達到最大有機化程度84.17%。由于螺旋藻鈣元素富集最佳培養周期為7 d,在最有利于鈣富集條件下,螺旋藻生長所受影響較小。因此,第7 d作為螺旋藻鈣元素富集最佳采收時間,此時細胞內鈣有機化程度達為84.17%,鈣含量為18.21 mg/g。

2.2.2 鐵對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.2.1 不同鐵富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同鐵富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響見圖4。

圖4 鐵富集時間對螺旋藻生長的影響Fig.4 Effect of different iron accumulation time on the growth of Spirulina

由圖4可見,在整個培養周期內,實驗組螺旋藻生長速率低于對照組,鐵富集條件對螺旋藻生長產生一定影響。在整個實驗過程中,在第3、5、7 d時,實驗組相比于對照組光密度下降百分比分別為:11.96%、15.55%、17.92%,隨時間延長,實驗組生長量比對照組生長量降低幅度呈增加趨勢。

2.2.2.2 鈍頂螺旋藻富集鐵元素含量隨時間變化規律 通過上述實驗獲得富鐵螺旋藻,分別于第3、5、7 d,收獲螺旋藻細胞,凍干后進行鐵元素含量及有機化測定,鈍頂螺旋藻鐵總含量及有機化程度隨培養時間變化規律見圖5。

圖5 鈍頂螺旋藻富集鐵元素含量隨時間變化規律Fig.5 Iron accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

由圖5可知,螺旋藻鐵的富集總量隨時間延長呈先上升后下降,在生長周期末期又回升的現象,螺旋藻鐵的有機化程度在這個培養期內均在80%以上。螺旋藻鐵積累量第3 d比初始值增加了59%,達到最高值1634 ppm,此時有機化程度為89.98%。而到達第5 d時,螺旋藻鐵有機化程度比第3 d增加0.12%，但由于部分二價鐵離子被氧化成為三價鐵,生成磚紅色氫氧化鐵不溶性沉淀,使得鐵總含量卻降低了15.24%。

因此,鈍頂螺旋藻鐵元素最佳培養周期為3 d,此時螺旋藻生長所受影響較小,鐵元素富集量最多,含量為1634 ppm,螺旋藻鐵的有機化程度為89.98%,維持較高水平。

2.2.3 鋅對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.3.1 不同鋅富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同鋅富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響生長曲線見圖6。

圖6 鋅富集時間對螺旋藻生長的影響Fig.6 Effect of different Zinc accumulation time on the growth of Spirulina

由圖6可見,在整個培養期內,實驗組與對照組螺旋藻均成穩定增長的趨勢,對照組光密度值略大于實驗組,但兩者之間生長速率差異不大,實驗組比對照組生長速率平均降低4.2%。最佳鋅富集條件下,螺旋藻生長未受到顯著(p<0.05)影響。

2.2.3.2 鈍頂螺旋藻富集鋅元素含量隨時間變化規律 上述實驗中,分別于第3、5、7 d,收獲螺旋藻細胞,凍干后進行鋅元素含量及有機化測定,其結果見圖7。

圖7 鈍頂螺旋藻富集鋅元素含量隨時間變化規律Fig.7 Zinc accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

由圖7可見,螺旋藻鋅含量呈逐漸上升趨勢,在培養周期的第3 d,鈍頂螺旋藻鋅元素有機化程度最高,為58.28%,是初始值的3.4倍,鋅元素的富集量為88.30 ppm;到達第7 d時,雖然鋅元素的富集量可達132.75 ppm,但有機化程度僅為5.34%。因此,螺旋藻鋅富集最佳培養周期為3 d,此時螺旋藻鋅的有機化程度達到58.28%,鋅富集量為88.30 ppm。

2.2.4 硒對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.4.1 不同硒富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同硒富集時間對鈍頂螺旋藻生長的影響結果見圖8。

圖8 硒富集時間對螺旋藻生長的影響Fig.8 Effect of different selenium accumulation time on the growth of Spirulina

由圖8可知,隨著培養時間的增加,實驗組光密度值顯著(p<0.05)低于對照組,說明硒對螺旋藻細胞產生一定脅迫作用,并且在培養后期由于藻細胞將亞硒酸根離子轉化成易揮發性硒化物而導致培養液散發出一股刺激性氣味[26],但選擇合適的硒離子濃度添加,可使得這種對于生長量的影響維持在20%以內。

2.2.4.2 鈍頂螺旋藻富集硒元素含量隨時間變化規律 由圖9可見,在100 mg/L Na2SeO3添加濃度下,螺旋藻硒元素含量及有機化程度均呈先上升后下降的趨勢,變化趨勢相同,兩者均在周期培養第5 d達到最大值,螺旋藻總硒含量為1011 ppm,有機化程度為70.54%;相比于培養第3 d,螺旋藻含硒總量增加153%,有機化程度增加20%,增幅明顯。

圖9 鈍頂螺旋藻富集硒元素含量隨時間變化規律Fig.9 Selenium accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

因此,鈍頂螺旋藻對硒元素最佳富集時間為5 d,此時螺旋藻硒總含量最高達到1011 ppm,有機化程度為70.54%,在此條件下,螺旋藻生長量相比于最佳生長量降低12.9%。

2.3 螺旋藻蛋白與幾種礦物質元素結合及其有機化程度分析

2.3.1 富鈣、富鐵、富鋅、富硒螺旋藻蛋白分別與鈣、鐵、鋅、硒的有機化結合程度分析 由表5可見,在富鈣條件下培養的螺旋藻干粉的總鈣含量為18.21 mg/g,從藻粉中提取的總蛋白含量為470 mg/g,由實驗結果可知總蛋白中鈣含量為1.07 mg/g,經測定,螺旋藻總蛋白含量是67.6%,以提取總蛋白含鈣量計算藻粉總蛋白中鈣的含量為1.04 mg/g;對比富鈣螺旋藻粉蛋白含鈣量與螺旋藻含鈣總量,富鈣螺旋藻粉總蛋白中鈣含量占總鈣的5.71%,占有機鈣含量的6.78%。實驗結果表明,鈣與蛋白質有機結合程度較低,而鈣具體有機化結合方式還有待進一步研究。

表5 富鈣螺旋藻蛋白與鈣的有機結合情況Table 5 Calcium-rich Spirulina protein’s organic binding of calcium

由表6可見,富鐵螺旋藻干粉的總鐵含量為1634.34 ppm,有機鐵含量為1470.63 ppm,有機化程度為89.98%,有機化程度較高,這表明螺旋藻有效的將無機鐵在細胞內轉化為有機鐵。從藻粉中分離提取的總蛋白含量為474 mg/g,提取總蛋白中鐵含量為872.64 ppm,經測定,螺旋藻總蛋白含量是67.5%,以經計算得出螺旋藻干粉中蛋白的含鐵量為838.81 ppm;對比富鐵螺旋藻粉蛋白含鐵量與螺旋藻含鐵總量,富鐵螺旋藻粉總蛋白中鐵含量占總鐵含量的51.32%,占有機鐵含量的57.00%。

表6 富鐵、富鋅、富硒螺旋藻蛋白與鈣的有機結合情況Table 6 Iron-rich,zinc-rich and selenium-rich Spirulina protein’s organic binding of calcium

富鋅螺旋藻干粉的總鋅含量為88.30 ppm,有機鋅含量為36.84 ppm,螺旋藻鋅有機化程度為58.28%,這表明螺旋藻在一定程度上將無機鋅轉化為有機鋅。從藻粉中分離提取的總蛋白含量為466 mg/g,提取總蛋白中鋅含量為30.26 ppm,經測得螺旋藻粉總蛋白含量是66.8%,計算得知螺旋藻粉總蛋白中鋅含量為28.98 ppm;對比富鋅螺旋藻粉蛋白含鋅量與螺旋藻含鋅總量,富鋅螺旋藻粉總蛋白中鋅含量占總鋅的32.82%。占有機鋅含量的78.66%。這表明,有機鋅的結合態中,超過三分之二是與蛋白質結合。

富硒螺旋藻干粉的總硒含量為1011.00 ppm,而從藻粉中分離提取的總蛋白含量為455 mg/g。提取總蛋白中硒含量為513.64 ppm,經測定,螺旋藻總蛋白含量是66.3%,以提取總蛋白含硒量推算螺旋藻粉總蛋白中硒含量為496.22 ppm,對比富硒螺旋藻粉蛋白含硒量與螺旋藻含硒總量,富硒螺旋藻粉總蛋白中硒含量占總硒的49.08%。占有機硒含量的69.58%,這說明硒在螺旋藻中主要是與蛋白質結合。

2.3.2 螺旋藻蛋白結合礦物質營養元素有機化程度分析 對Z氏培養液培養的螺旋藻干粉(對照組)及最優富礦物質營養元素條件下培養的螺旋藻干粉(實驗組)進行紅外圖譜掃描,圖譜結果見圖10。

圖10 紅外吸收光譜圖Fig.10 Infrared absorption spectroscopy注:a為對照組;b為富鈣培養螺旋藻;c為富鐵培養螺旋藻;d為富鋅培養螺旋藻;e為富硒培養螺旋藻。

圖10中,與對照相比,添加過四種不同離子的樣品在原波長為3352 cm-1處的吸收峰都有不同程度的藍移現象,并且吸收峰減小,造成這種藍移的現象是由于在加入以上四種離子后,羥基和胺基的混合峰的吸收峰減小,說明細胞表面氫鍵減弱,同時也說明藻體結合上述四種離子之后,羥基和胺基可能參與離子吸附與吸收,引起伸縮振動的最大峰位移。在2927 cm-1處甲基和亞甲基伸縮振動的相對強度減弱,這表明脂質對上述離子吸收也產生了不同程度的作用;由于螺旋藻是一種蛋白含量極其豐富的藻類,所以存在兩個顯著的紅外光譜特征峰,分別是由于C=O的伸縮振動產生位于1658 cm-1吸收峰對應于酰胺I,由于 NH2剪式振動吸收產生的位于1545 cm-1處的吸收峰是酰胺II。與對照相比,僅鈣離子可造成酰胺I特征的位移,這說明酰胺I中的C=O參與鈣離子配位,而四種離子都造成了酰胺II特征峰的改變。很顯然,上述的四種離子都與氨基酸中N-H彎曲振動(60%)和多肽鏈、碳骨架中的 C-N伸縮振動(40%)產生,這說明N-H同時參與離子配位[27]。由于多糖分子中存在多個C-OH基團,因此在1100～1000 cm-1之間出現多個C-O伸縮振動吸收峰,可能含有P-O-C伸縮振動的貢獻;同時,在1000～800 cm-1之間發生了糖環的環振動,推測螺旋藻上述四種離子積累與糖類物質密不可分。

另外,由于藻細胞的細胞壁對鈣離子進行有效吸附和吸收,因此位于1160 cm-1由于細胞壁上主要成分-碳水化合物中C-O鍵的伸縮振動產生吸收峰峰面積增加;螺旋藻富集鐵離子和硒離子之后1320 cm-1處C-O振動收縮峰消失,1240 cm-1C-O伸縮振動加強,這是蛋白質和脂肪酸吸收鐵離子后的結構變化。在添加硒離子后,在624 cm-1處,峰位由624.93 cm-1偏移至577.92 cm-1,吸收峰強度降低,這是由N-H面外變形振動形成氫鍵,使波峰向低波數移動[28]。

3 結論

本實驗通過對主要影響螺旋藻生長的環境因子(溫度、光照、pH)進行調控,確定螺旋藻最佳生長量的環境條件為:溫度30 ℃,光照12 kLux,pH9.5。鈣積累的最佳條件為:溫度20 ℃,光照12 kLux,pH8.5,鈣積累量提高了97%,外源添加0.6 g/L CaCO3,培養7 d收獲,螺旋藻鈣總含量和其有機化程度分別達到18.21 mg/g,84.17%。鐵元素積累最佳條件為:溫度30 ℃,光照4 kLux,pH10.5,鐵積累量提高了175%,外源添加FeSO4·7H2O濃度至40 mg/L,培養3 d后收獲,螺旋藻中鐵總含量及有機化程度分別達到1634.34 ppm,89.98%。鋅元素積累最有佳條件為:30 ℃,8 kLux,pH8.5,在此條件下同時外源添加ZnSO4·7H2O濃度至40 mg/L,培養3 d后收獲,鋅有機化程度最高,螺旋藻最高鋅含量和有機化程度分別達到88.30 ppm,58.28%。硒元素積累最有利條件為:30 ℃,12 kLux,pH9.5,在此條件下外源添加100 mg/L Na2SeO3培養5 d后收獲,螺旋藻中硒元素總含量及有機化程度達到最大值,螺旋藻中硒元素總含量及有機化程度分別為1011.00 ppm,70.54%。

由此可見,鋅、硒和鐵與蛋白質結合程度較高,占有機化程度的50%以上,這具有開發富礦質營養蛋白粉和食品添加的潛力。只有鈣與蛋白質結合不足10%,定性研究表明其還可能與多糖和脂類結合,其他三種元素也具有此共性。本項研究實現了螺旋藻生長和營養元素積累同時調控,無機元素通過螺旋藻細胞載體實現高度有機化,在醫藥、食品、化妝品領域具有重要的應用價值。