孝感米酒中乳酸菌的分離及其對黃酒品質的影響

楊小麗,高 航,徐寶釵,趙慧君,馬佳佳,張振東

(湖北文理學院食品科學技術學院,鄂西北傳統發酵食品研究所,湖北襄陽 441053)

黃酒是世界三大釀造酒之一,擁有數千年的歷史。在國內多個省份,人們都能以稻米或者糯米為主要原料,經過蒸料后加入酒藥及酒母作為發酵劑,經糖化發酵作用釀制出酒精含量8%～16%的黃酒。黃酒主要流行于我國南方地區,特別是浙江與福建地區尤盛。黃酒具有很多保健功效,如抗氧化,降血壓、降血脂和降膽固醇,另外由于黃酒香濃、味醇的特點,深受人們喜愛[1-2]。

乳酸菌對傳統發酵食品的風味形成與品質穩定起到重要作用。多項研究表明,黃酒發酵環境中存在著豐富的乳酸菌[3-4]。黃酒的釀造離不開乳酸菌的參與:由乳酸代謝產生的乳酸等有機酸與酵母發酵生成的乙醇經酯化反應生成乳酸乙酯等酯類,酯類含量的多少在一定程度上決定了黃酒的風味,因此乳酸菌的代謝作用提高了黃酒風味的復雜性[2,5]。對米酒發酵劑及黃酒發酵劑中的微生物研究表明,乳酸菌在占有較大比例,然而目前對利用乳酸菌改進黃酒品質的報道仍然較少,對黃酒源乳酸菌的開發與利用有待于加強。

黃酒與米酒原料類似,而發酵工藝卻存在較大差異,但是不少研究人員從黃酒與米酒環境中獲得了乳酸菌資源。因此,本研究從孝感民間釀制的米酒中對乳酸菌進行了分離,并在黃酒發酵起始時,將分離到的乳酸菌作為發酵劑接入到黃酒中以評價獲得的乳酸菌分離菌株對黃酒品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒樣品 采集于湖北省孝感市農戶家庭;MRS培養基 青島海博生物技術有限公司;Axygen PCR清潔試劑盒 康寧生命科學吳江有限公司;DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq DNA聚合酶、pMD18-T克隆載體 寶生物工程(大連)有限公司;Escherichiacolitop10 實驗室保存;引物27F與1492R 天一輝遠生物科技有限公司合成;糯米 襄陽市鑫源超市;麥曲 襄陽市臥龍鎮農貿市場用;酒母 麗水力克生物科技有限公司;甘油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、正磷酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸 分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司;0.45 μm濾頭(水系) 上海安普生物科技有限公司;電子舌滋味測定用的參比溶液、內部溶液、外部溶液 日本Insent公司。

HR40-ⅡB2型生物安全柜 青島海爾中國;QYC-2102C全溫培養搖床 上海新苗;SA402B味覺分析系統 日本INSENT公司;LC-20ADXR液相色譜儀 日本Shimadzu公司;PTC-100PCR儀 美國ABI公司;Fluor Chem FC3化學發光凝膠成像系統 美國ProteinSimple公司;Abbemat 350全自動折光儀 奧地利安東帕公司;SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 蘇州安泰;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐;DG250厭氧工作站 英國Don Whitley公司;6盤蒸飯機 樂創自動化技術股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離 將采集到的米酒樣品裝入樣品瓶中放入樣品箱迅速帶回實驗室。乳酸菌的分離采用倍比稀釋法,取適當梯度稀釋液涂布于MRS固體培養基,于DG250厭氧工作站30 ℃培養48 h,然后按照菌落形態的特點,挑取單菌落并純化3次,然后進行革蘭氏染色與過氧化氫酶實驗[6],初步確認為乳酸菌后,使用30%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 乳酸菌的鑒定 乳酸菌的鑒定主要通過分析16S rDNA基因的系統發育關系進行確定:首先收集乳酸菌菌體,然后按照細菌DNA提取的標準方法[7]獲得乳酸菌總DNA,并以之為模板進行PCR擴增。PCR引物使用27F與1495R[8],PCR擴增參照Mveobiang等[7]程序進行。獲得PCR產物后,進行連接與轉化,隨后挑取陽性克隆子,送南京金絲瑞生物科技公司進行測序。在NCBI進行Blast,選取序列相似度≥99%的序列進行系統發育關系分析。

1.2.3 黃酒制作 黃酒的制作工藝流程為:原料→浸米→蒸煮→發酵→后熟→澄清→煎酒(除菌)→成品。先稱取糯米經室溫(25 ℃左右)浸泡約2 d,使用蒸飯機蒸熟約40 min至米無生心且不爛,攤晾至室溫后裝入發酵罐中。設置對照組:只加入麥曲(78.5 g麥曲/500 g糯米)與酒母(0.5 g酒母/500 g糯米)作為發酵劑,不接入乳酸菌干預;設置乳酸菌干預組:發酵劑為麥曲(78.5 g麥曲/500 g糯米)與酒母(0.5 g酒母/500 g糯米)及各乳酸菌分離株(乳酸菌終濃度為105cfu/g糯米)。各組黃酒加入發酵劑后,再加入泡米漿水295 mL、煮沸后的冷水390 mL,攪拌均勻并按照接入乳酸菌菌株名稱編號,然后置于28 ℃發酵7 d,再18 ℃發酵14 d。黃酒發酵完成后,取400 mL以3000 r/min樣品離心10 min后取上清液,煮沸冷卻至室溫后裝入樣品瓶中備用。

1.2.4 黃酒品質評價

1.2.4.1 黃酒樣品中有機酸的測定 使用高效液相色譜對黃酒樣品的有機酸進行測定。樣品處理:取2 mL黃酒樣品使用超純水定容到10 mL,然后取5 mL溶液過0.45 μm濾頭,隨后裝于樣品瓶中待測。先配制草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和乳酸這些食品中常見有機酸制作標準曲線,然后按照以下色譜條件進行有機酸的測定[9]:ZORBAX SB-AQ(4.6×250 mm,5 μm);流動相:0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(使用正磷酸調節pH至2.9),柱溫為30 ℃,流速為1 mL/min,進樣體積為20 μL。

1.2.4.2 黃酒樣品的滋味分析 取黃酒樣品在3000 r/min離心10 min后的上清液,參照王玉榮等[10]的方法,使用電子舌測定各黃酒樣品的酸、苦、澀、鮮和咸,5個基本味,以及3個基本味苦味、澀味、鮮味的回味。先將電極活化,測得酸、苦、澀、鮮和咸味這些基本味值,然后再測得3個回味的強度值。將未接乳酸菌的對照處理黃酒樣品的滋味定義為0,測得的均為滋味的相對強度。

1.2.4.3 可溶性固形物的測定 參照國標GB/T 12143-2008使用阿貝折光儀進行[11],測定條件為20 ℃,直接在儀器上讀出可溶性固形物數值并記錄。

1.3 統計分析

本文中圖均使用Origin 8.5繪制,顯著性分析使用SPSS 18.0中的LSD法計算,對黃酒滋味進行主成分分析法(Principal component analysis,PCA)使用past軟件進行。

2 結果與分析

2.1 黃酒樣品中乳酸菌的分離

通過傳統培養方法,以MRS培養基從傳統發酵方式獲得的襄陽米酒中共分離到9株形態各異的細菌,它們過氧化氫酶為陰性,且在含有1.5%碳酸鈣的MRS固體培養基上均有透明圈出現(見表1),初步判斷分離菌株是乳酸菌[12]。

表1 乳酸菌分離株形態觀察Table 1 Results of morphological observation of the isolated LAB

2.2 乳酸菌分離株的鑒定

通過PCR獲得的乳酸菌分離株的16S rDNA基因,對比DNA Marker,獲得的PCR片段大小為1500 bp左右(見圖1),與文獻報道的16S rDNA基因大小相當[13]。然后將PCR產物進行純化并與pMD18-T克隆載體連接后,進行轉化后挑陽性克隆子進行測序。隨后將獲得的乳酸菌菌株16S rDNA基因序列進行了比對。同時選取相似度較高的已公布的乳酸菌模式種的16S rDNA基因序列構建系統發育樹,以進行系統發育分析。

圖1 乳酸菌分離菌株16S rDNA基因擴增片段電泳圖Fig.1 Agrose gel electrophoresis of 16S rDNA from isolated LAB strains by PCR注：M:DL2000 marker;1～9:乳酸菌分離株的16S rDNA基因的PCR產物。

由圖2可知,根據16S rDNA基因的系統發育分析,可將從米酒中分離得到的9株菌分為2個菌屬,分別是片球菌屬與魏斯氏菌屬。MJ5-1與MJ6-1,屬于片球菌屬,進一步分析表明,它們均屬于戊糖片球菌。

圖2 所分離乳酸菌16S rDNA基因系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated LAB based on the 16S rDNA gene

另外7株乳酸菌經過分析,將它們都歸為魏斯氏菌屬,可以細分為2個菌種,分別是融合魏斯氏菌與食竇魏斯氏菌。由圖2可知,MJ2-1、MJ3-1、MJ4-1屬于融合魏斯氏菌,而MJ7-1、MJ8-1、MJ9-1、MJ10-1屬于食竇魏斯氏菌。根據對黃酒中乳酸菌的報道,黃酒或者黃酒所用發酵劑中常見的乳酸菌類型[3-4]為腸球菌屬(Enterococcus),魏斯氏菌屬,明串珠菌屬(Leuconostoc),乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬,分離到的乳酸菌種屬與米酒研究的相關報道相一致[14-15],表明與米酒一樣,黃酒中的乳酸菌資源極為豐富,是乳酸菌的寶貴資源庫。另有研究認為,紅曲黃酒的紅曲中,則以伯克氏菌屬(Burkholderia)與芽孢桿菌屬(Bacillus)為主,另外也存在著上述的一些乳酸菌屬[16]。然而,本研究未從孝感地區米酒中分離得到腸球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬乳酸菌。

2.3 乳酸菌對黃酒有機酸的影響

在黃酒發酵過程中,淀粉質等原料組分被糖化發酵劑轉化為還原性糖類,然后被黃酒中的各類微生物代謝轉化成乙醇、有機酸、酯類等揮發性物質這些復雜多樣的代謝物,從而呈現出黃酒誘人風味品質與豐富的營養[2-3]。所以黃酒發酵工藝及發酵劑的選擇勢必會影響到黃酒的有機酸組成,對黃酒的滋味產生影響。

黃酒中主要有機酸類型包括檸檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸等,一般通過液相色譜法進行測定[17-18]。由圖3可知,釀制的黃酒中有機酸有乳酸、乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸,且樣品中的乳酸、琥珀酸和蘋果酸含量較高。與未接菌處理相比,乳酸菌干預處理黃酒樣品中琥珀酸、乙酸與檸檬酸未表現出顯著差異(p>0.05)。而接入乳酸菌MJ2-1處理黃酒樣品草酸增加到1.11 g/L,與未接菌處理相比增加了2.96倍。未接乳酸菌處理黃酒樣品乳酸與蘋果酸含量分別為6.35、6.09 g/L,接入乳酸菌MJ3-1、MJ4-1、MJ6-1與MJ8-1處理的黃酒樣品乳酸含量分別為8.48、19.68、8.78、8.81 g/L,蘋果酸含量分別為1.08、1.04、3.10、1.13 g/L,表明乳酸菌顯著改變了這些黃酒樣品的乳酸與蘋果酸組成(p<0.05)。

圖3 黃酒樣品有機酸含量Fig.3 Content of organic acid of Chinese rice wine samples

乳酸主要由乳酸菌代謝產生,由圖3可知,在添加乳酸菌的干預下,蘋果酸含量顯著減少(p<0.05),而乳酸含量顯著增加(p<0.05),尤其是在菌株MJ4-1減少蘋果酸增加乳酸的作用最強。蘋果酸酸度較乳酸高,有研究認為,在一些乳酸菌作用下會發生蘋果酸-乳酸發酵,將蘋果酸轉化成乳酸以降低酒類酸度,該作用主要用來進行葡萄酒降酸。結果顯示,4株乳酸菌MJ3-1、MJ4-1、MJ6-1與MJ8-1乳酸菌可能引發了黃酒發酵過程中的蘋果酸-乳酸代謝,使黃酒樣品中蘋果酸顯著降低(p<0.05),而融合魏斯氏菌MJ4-1對黃酒的蘋果酸乳酸發酵作用最強,與未接菌處理黃酒樣品相比黃酒乳酸含量增加了2倍多,而蘋果酸含量減少了85%,表明菌株MJ4-1是一株可以用作黃酒調酸的優良乳酸菌。

2.4 乳酸菌對黃酒滋味的影響

滋味品質是影響消費者選擇的一個重要因素,研究表明黃酒滋味主要在黃酒發酵的第8～15 d形成[19]。目前對影響黃酒滋味的微生物因素的研究尚少,使用優質黃酒發酵劑釀制出來的黃酒滋味體驗出色,更容易受到消費者的青睞。由于在食品的品鑒中,主觀因素可能會引起誤差,因此本研究對乳酸菌干預下的黃酒滋味使用電子舌進行了測定,結果見圖4。由圖可知,乳酸菌干預處理的黃酒樣品酸味、咸味與豐(厚)度均發生了顯著變化(p<0.05),酸味呈下降趨勢,而咸味與豐度顯著增加。結合有機酸測定結果,黃酒在乳酸菌的作用下,乳酸含量增加,而部分樣品蘋果酸含量減少,酸度有所降低,這與滋味測定結果相一致。

圖4 黃酒中各滋味相對強度Fig.4 Relative intensity of taste of Chinese rice wine samples注:標識‘*’表示對照組與乳酸菌處理組間差異顯著(p<0.05)。

2.5 黃酒樣品滋味品質的主成分分析

對乳酸菌滋味進行了的PCA分析以深入追溯乳酸菌對黃酒滋味品質的影響,結果如圖5和圖6所示。由圖5可知,第一主成分與第二組成分貢獻率為97.70%:第一組成分中,黃酒樣品滋味因素由酸味、鮮味和豐度構成,其貢獻率為89.76%;第二主成分由苦味、澀味、咸味、后味A(澀的回味)和后味B(苦的回味)3個滋味基本指標和兩個回味指標構成,貢獻率為7.94%。結果表明,乳酸菌對黃酒滋味的影響,主要由酸味、鮮味和豐度3個滋味基本指標的變化引起,與黃酒有機酸與滋味品質測定結果一致。

圖5 基于主成分分析的黃酒樣品滋味品質因子載荷圖Fig.5 Graphy of factor loading based on PCA of the taste profile characterization of the yellow wine

對黃酒樣品滋味進行了PCA分析,圖6展示了添加乳酸菌對黃酒滋味品質的PCA各因子得分,未添加乳酸菌發酵的黃酒樣品位于第三象限,而添加乳酸菌處理黃酒樣品聚集在第一、二、四象限,表現出了顯著性差異(p<0.05)。另外,黃酒樣品在滋味品質上呈現出了基于添加乳酸菌種屬的特征性分布,添加了融合魏斯氏菌MJ2-1、MJ3-1、MJ4-1的黃酒樣品聚集在一起,而添加了食竇魏斯氏菌MJ7-1、MJ8-1、MJ9-1、MJ10-1的黃酒樣品聚集在一起,但是戊糖片球菌MJ5-1與MJ6-1未分布在一起,表明魏斯氏菌屬各個種水平的乳酸菌對黃酒滋味品質的作用類似。

圖6 基于主成分分析的黃酒樣品滋味品質因子得分圖Fig.6 Graphy representation the component score by PCA of the taste profile characterization of the yellow wine

2.6 乳酸菌對黃酒固形物的影響

可溶性固形物是黃酒的一項重要指標,黃酒中的可溶性固形物主要指糖類物質組成。由圖7可知,對照組的可溶性固形物含量為8.39 g/100 g,而添加乳酸菌處理黃酒樣品的可溶性固形物含量均在11.28 g/100 g以上,較未接菌處理顯著增加(p<0.05),其中乳酸菌MJ2-1、MJ5-1與MJ10-1干預下的黃酒樣品固形物增加得最多,是未接菌處理樣品的1.56倍左右。在魏斯氏菌MJ4-1作用下,黃酒固形物增加了34%,為乳酸菌處理組最低。

圖7 黃酒樣品可溶性固形物含量Fig.7 Content of soluble solid of yellow wine samples注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結論

孝感米酒中蘊含著豐富的乳酸菌資源,從孝感米酒中分離得到9株乳酸菌并進行了鑒定,結果顯示分離到的乳酸菌屬于片球菌和魏斯氏菌兩個菌屬,屬于戊糖片球菌、融合魏斯氏菌與食竇魏斯氏菌3個菌種。將分離并鑒定了的乳酸菌添加到黃酒醪液中進行共發酵,結果顯示它們對黃酒的有機酸含量、固形物及滋味品質均有影響。在融合魏斯氏菌MJ3-1、MJ4-1、戊糖片球菌MJ6-1與食竇魏斯氏菌MJ8-1干預下,黃酒乳酸含量顯著增加(p<0.05),蘋果酸顯著減少(p<0.05),其中尤其是融合魏斯氏菌MJ4-1的乳酸-蘋果酸轉化作用最強,可用于黃酒有機酸調酸,是開發黃酒復合型發酵劑的優秀候選菌株。對黃酒滋味的分析表明,乳酸菌干預下,黃酒的酸味、咸味和豐度發生了顯著變化(p<0.05)。基于PCA分析,分離到的魏斯氏乳酸菌對黃酒滋味影響較為相近。