利用Saccharomyces cerevisiae KD控制蘋果汁中棒曲霉素的污染

朱瑞瑜,陳水鋁,黃聰輝,樓芳菲,尤玉如,馬莉莉

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310023;3.Coalescence,LLC,美國俄亥俄州 43219)

據(jù)美國農(nóng)業(yè)部(USDA)官網(wǎng)2017年的報(bào)道,全世界每年大約有25%的農(nóng)作物受到真菌毒素的污染;真菌毒素污染成為我國農(nóng)產(chǎn)品出口歐盟的最大阻礙[1-2]。棒曲霉素是自然界中一種常見的真菌毒素,廣泛存在于水果、蔬菜、谷物、海鮮、堅(jiān)果及其制品中。棒曲霉素對(duì)細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動(dòng)物以及人類均有毒害作用[3]。短時(shí)間內(nèi)大量攝入棒曲霉素會(huì)引起急性中毒,表現(xiàn)為惡心、嘔吐,腸胃功能紊亂、膀胱和肝臟等器官病變等;慢性中毒包括誘發(fā)腫瘤、致癌、致畸及潛在的遺傳毒性等[4-6]。雖然各國家和地區(qū)設(shè)立了棒曲霉素在食品中的限量標(biāo)準(zhǔn),但棒曲霉素的污染依然較為普遍。2017年中國的一次抽檢結(jié)果顯示,在由果汁、果干、果醬組成的137個(gè)樣品中,棒曲霉素的檢出率為31%,超標(biāo)率為17.5%[7]。

微生物法被認(rèn)為是一種有效去除棒曲霉素的方法之一。近幾年來,已分離得到多種可去除棒曲霉素的菌株,比如Candidaguilliermondii[8]、Sporobolomycessp[9]、Rhodosporidiumpaludigenum[10]、Rhizopusisolates[11]以及Pichiacaribbica[12]等。然而,這些已報(bào)道的微生物中,絕大多數(shù)并非食品生產(chǎn)用微生物,因而無法直接應(yīng)用到食品中。

本文研究了食品生產(chǎn)用微生物SaccharomycescerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素的去除作用,并將其應(yīng)用到被棒曲霉素污染的市售100%蘋果汁中,發(fā)酵2 d后對(duì)發(fā)酵蘋果汁的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià),以期為降低果汁中棒曲霉素的污染提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

商業(yè)化葡萄酒釀造菌株(SaccharomycescerevisiaeVitilevure KD) 法國Martin Vialatte;乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.cremorisMG1363) 德國MoBiTec;氫氧化鈉、沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、酚酞指示劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;抗壞血酸(>99.0%)、無水乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、醋酸鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NYDB液體培養(yǎng)基(8 g牛肉浸膏、5 g酵母浸出粉和10 g葡萄糖溶于1 L蒸餾水);MRS培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司;100%蘋果汁 北京匯源食品飲料有限公司。

Waters 2695液相制備色譜 美國Waters;SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices;NDK-12W水浴氮吹儀 上海皓莊(LNB)儀器有限公司;SW-CJ-1FD凈化工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠司;BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BS-IEA振蕩培養(yǎng)箱 國華電器有限公司;手持折光儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司;Milli-Q Academic超純水儀 美國Milli-pore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1S.cerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素的去除作用 將活化兩代的S.cerevisiaeKD接種于無菌NYDB液體培養(yǎng)基中,使其菌體起始濃度為107CFU/mL,同時(shí)加入棒曲霉素,使培養(yǎng)基中棒曲霉素濃度分別為0、1 mg/L(0為對(duì)照組)。將樣品置于28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)12、16、20、24、28 h后,離心取上清液,檢測(cè)培養(yǎng)液中棒曲霉素的含量。

1.2.2 滅活和活體S.cerevisiaeKD菌體對(duì)棒曲霉素的去除作用 在28 ℃、150 r/min振蕩條件下大量培養(yǎng)S.cerevisiaeKD,48 h后將菌液等量分成兩組,其中一組于85 ℃水浴30 min,滅活酵母;另一組不做任何處理。分別向兩組菌液以及無菌NYDB培養(yǎng)基(作為對(duì)照)中加入等量的棒曲霉素,使得體系中棒曲霉素濃度為5 mg/L。將上述處理置于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)1、3 d后分別檢測(cè)菌液中棒曲霉素的殘留量。

1.2.3 棒曲霉素起始濃度和菌體起始濃度對(duì)S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 向無菌NYDB液體培養(yǎng)基中加入棒曲霉素,使得棒曲霉素起始濃度分別為1、10、30、50 mg/L;將S.cerevisiaeKD接種到上述培養(yǎng)基中,接種量為107CFU/mL;以含等量棒曲霉素但不含S.cerevisiaeKD的培養(yǎng)基作為對(duì)照。將樣品置于28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)12、24、36 h后，檢測(cè)培養(yǎng)液中棒曲霉素的含量。

將S.cerevisiaeKD接種到NYDB液體培養(yǎng)基中,起始接種量分別為0、105、106、107CFU/mL(0為對(duì)照組);向上述培養(yǎng)基中加入棒曲霉素,使其起始濃度為5 mg/L。將樣品置于28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)6、12、24、36 h后，檢測(cè)培養(yǎng)液中棒曲霉素的含量。

1.2.4 培養(yǎng)基pH對(duì)S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 用NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)將NYDB培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0。將活化好的S.cerevisiaeKD分別接種到上述不同pH的培養(yǎng)基中,接種量為0、107CFU/mL(0為對(duì)照),培養(yǎng)基中棒曲霉素起始濃度為5 mg/L。將96孔板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,每隔3 h測(cè)定菌體吸光值(OD600),并分別在12、24、36、48 h檢測(cè)培養(yǎng)液中棒曲霉素的含量。

1.2.5S.cerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素的耐受力 將活化兩代的S.cerevisiaeKD接種到含NYDB培養(yǎng)基的96孔板中,使得培養(yǎng)基中起始菌體濃度為107CFU/mL,棒曲霉素的起始濃度分別為0、3、5、10、50、100 mg/L。將96孔板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)33 h,每隔3 h測(cè)定菌體吸光值(OD600)。

1.2.6S.cerevisiae和L.lactis對(duì)蘋果汁中棒曲霉素的去除作用及發(fā)酵果汁的品質(zhì)評(píng)估 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),L.lactisMG1363能夠有效去除液體中的棒曲霉素(數(shù)據(jù)未顯示)。將S.cerevisiae和L.lactis混合接種于市售100%蘋果汁中(棒曲霉素起始濃度為5 mg/L),并設(shè)置不同的處理對(duì)蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵。處理一:兩菌株初始濃度均為5×106CFU/mL,樣品置于33 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h;處理二:5×106CFU/mL的S.cerevisiae置于28 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后,加入5×106CFU/mL的L.lactis,樣品置于33 ℃、120 r/min的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;處理三與處理二相同,但全程均為靜置培養(yǎng);處理四:兩菌株起始濃度均為5×106CFU/mL,樣品置于33 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后,繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h。除了處理三外,其余樣品在培養(yǎng)前均添加9%蔗糖。培養(yǎng)結(jié)束后,對(duì)樣品中棒曲霉素的殘留量進(jìn)行了測(cè)定,并對(duì)發(fā)酵蘋果汁的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)估,主要檢測(cè)了樣品中的可溶性固形物、酸度、黃酮和總酚的含量。

1.2.7 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.7.1 發(fā)酵后蘋果汁品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定 利用手持折光儀檢測(cè)可溶性固形物;總酸的測(cè)定參考國標(biāo)GB/T 12456-2008[13]的方法進(jìn)行,最后結(jié)果以蘋果酸表示(蘋果酸換算系數(shù)為0.067);總酚的檢測(cè)參照國標(biāo)GB/T 31740.2-2015[14]的方法進(jìn)行;黃酮含量的檢測(cè)參照鄭亞美等[15]的方法進(jìn)行。設(shè)置未經(jīng)任何處理的市售100%純蘋果汁作為對(duì)照。

1.2.7.2 棒曲霉素的提取與檢測(cè) 棒曲霉素的提取方法:向待測(cè)溶液中加入等體積乙酸乙酯,于180 r/min小搖床中震搖 3 h后,于3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min,收集有機(jī)相并于40 ℃水浴下進(jìn)行氮吹,用AABS緩沖液(0.45 mL冰醋酸、0.15 g醋酸鈉溶解于40 mL雙蒸水中,調(diào)整pH至4.0)溶解、過濾,待用。

棒曲霉素含量檢測(cè)參考Zhu等[16]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改:采用高效液相色譜系統(tǒng),選取C-18反向色譜柱(Phenomenex 250×4.6 mm,5 μm,USA),流動(dòng)相為水(0.04%乙酸,v/v)和乙腈90∶10(v/v),流速1 mL/min。檢測(cè)波長為276 nm,柱溫恒定為35 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

棒曲霉素去除率(%)=(對(duì)照組棒曲霉素含量-處理組棒曲霉素含量)/對(duì)照組棒曲霉素含量×100

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的棒曲霉素含量計(jì)算公式如下:

x=(y+605.71)/135.87,R2=0.9999;其中,x為棒曲霉素含量(μg/L),y為峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定菌體吸光值實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)平行,其他實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS軟件22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏差異分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. cerevisiae KD對(duì)棒曲霉素的去除作用

2.1.1S.cerevisiaeKD在NYDB培養(yǎng)基中對(duì)棒曲霉素的去除作用S.cerevisiaeKD可以有效降低培養(yǎng)基中棒曲霉素的含量,結(jié)果如表1所示。有氧培養(yǎng)12 h后,S.cerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素的去除率為74.9%;培養(yǎng)28 h后，培養(yǎng)基中已檢測(cè)不到棒曲霉素。Moss等[17]利用S.cerevisiae71B降解棒曲霉素,發(fā)現(xiàn)在有氧條件下培養(yǎng)100 h后,棒曲霉素含量只減少了約20%。因此,本研究中選用的S.cerevisiaeKD在有氧條件下，可高效去除培養(yǎng)基中的棒曲霉素。為探尋S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的機(jī)理,本研究比較了滅活酵母和活體酵母對(duì)棒曲霉素含量的影響,結(jié)果如圖1所示。

表1 S. cerevisiae KD在NYDB培養(yǎng)基中對(duì)棒曲霉素的去除率Table 1 Patulin reduction rate by S. cerevisiaeKD in NYDB medium

2.1.2 滅活和活體S.cerevisiaeKD菌體對(duì)棒曲霉素的去除作用 由圖1可知,滅活酵母可降低溶液中棒曲霉素的含量,由此推斷S.cerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素有物理吸附作用。在相同的培養(yǎng)條件下,活體酵母對(duì)棒曲霉素的去除率明顯高于滅活酵母:培養(yǎng)1 d時(shí),活體酵母對(duì)棒曲霉素的去除率為79.35%,而滅活酵母去除率僅為21.92%;培養(yǎng)3 d后,活體酵母去除率達(dá)到97.82%,滅活酵母去除率沒有顯著變化(p>0.05)。此外,S.cerevisiaeKD在本實(shí)驗(yàn)前期已培養(yǎng)了48 h,達(dá)到了穩(wěn)定期,酵母菌體不再進(jìn)行數(shù)量上的增長,但隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，活體酵母組的棒曲霉素濃度出現(xiàn)了顯著的下降(p<0.05),從而推斷S.cerevisiaeKD可以酶解棒曲霉素。由此可知,S.cerevisiaeKD既能物理吸附棒曲霉素,又能生物降解棒曲霉素。酵母細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)與多糖和菌體吸附棒曲霉素緊密相關(guān),而菌體表面的疏水作用在吸附棒曲霉素的過程中，也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18]。雖然目前已證實(shí)，不少微生物可以生物酶解棒曲霉素,然而迄今為止,尚未有報(bào)道分離純化得到微生物降解棒曲霉素的相關(guān)酶類[9,16]。

圖1 滅活和活體S. cerevisiae KD菌體對(duì)棒曲霉素的去除作用(NYDB培養(yǎng)基中)Fig.1 Patulin reduction by inactivated and viable cells of S. cerevisiae KD in NYDB medium注:“*”表示同一處理下3 d與1 d的降解率相比有顯著差異(p<0.05)。

2.1.3 棒曲霉素起始濃度和菌體起始濃度對(duì)S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 棒曲霉素起始濃度對(duì)S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響如圖2所示,當(dāng)棒曲霉素濃度高達(dá)50 mg/L,S.cerevisiae依然可有效去除棒曲霉素。培養(yǎng)24 h后,棒曲霉素濃度為1、10、30、50 mg/L處理組的去除率分別為93.8%、83.7%、65.7%和58.4%。S.cerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素的去除率隨起始棒曲霉素濃度升高而降低,這和棒曲霉素對(duì)酵母有毒性相關(guān)[3]。

圖2 棒曲霉素起始濃度對(duì)S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影響(NYDB培養(yǎng)基中)Fig.2 Influence of initial patulin concentration on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

酵母起始濃度越高,在初始階段對(duì)棒曲霉素的去除效率越高(圖3)。當(dāng)S.cerevisiaeKD濃度為106、107CFU/mL時(shí),其對(duì)棒曲霉素的去除率明顯高于酵母濃度為105CFU/mL的處理組。但當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到36 h時(shí),各組棒曲霉素的去除率均趨于100%。隨著菌體的生長和對(duì)棒曲霉素環(huán)境的適應(yīng),在培養(yǎng)后期較高的菌體起始濃度處理組不一定在棒曲霉素降解能力上呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)。Cao等[19]發(fā)現(xiàn),當(dāng)酵母起始濃度為109CFU/mL 時(shí),培養(yǎng)15 d后其降解效果低于起始濃度為5×108CFU/mL的處理組。

圖3 酵母起始濃度對(duì)S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影響(NYDB培養(yǎng)基中)Fig.3 Influence of initial yeast concentration on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

2.1.4 培養(yǎng)基pH對(duì)S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 由圖4可知,當(dāng)起始pH在4.0～6.0之間時(shí),S.cerevisiae對(duì)棒曲霉素有較好的去除效果。而不同pH下菌株的生長曲線(圖5)表明,S.cerevisiae在pH為5.0和6.0的培養(yǎng)基中時(shí),生長狀態(tài)較佳,由此可見,菌體去除棒曲霉素的能力和生長狀態(tài)有相關(guān)性。

圖4 NYDB培養(yǎng)基pH對(duì)S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影響Fig.4 Influence of pH value on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

圖5 NYDB培養(yǎng)基pH對(duì)S. cerevisiae KD生長的影響Fig.5 Influence of pH value on the growth of S. cerevisiae KD in NYDB medium

2.2 S. cerevisiae KD對(duì)棒曲霉素的耐受力

不同濃度的棒曲霉素對(duì)S.cerevisiaeKD生長的影響如圖6所示。當(dāng)棒曲霉素濃度在3～100 mg/L范圍內(nèi),S.cerevisiaeKD均能生長。在低棒曲霉素濃度(0～5 mg/L)下,菌體的生長并未受到明顯的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中棒曲霉素的濃度為10 mg/L時(shí),菌體的生長受到輕微抑制。據(jù)報(bào)道,棒曲霉素能破壞細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性,對(duì)酵母產(chǎn)生毒害作用,當(dāng)棒曲霉素濃度為8 mg/L 時(shí),能完全抑制酵母Schizosaccharomycespombe的生長[20]。而在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)棒曲霉素濃度低于10 mg/L時(shí),S.cerevisiaeKD的生長并未受到明顯影響;當(dāng)棒曲霉素濃度高至50 mg/L時(shí),菌體的生長受到明顯抑制。然而,菌體在棒曲霉素濃度高達(dá)100 mg/L時(shí)依然能生長。因此推測(cè),菌體可能通過降解棒曲霉素來增強(qiáng)自身對(duì)棒曲霉素的耐受力,這與Castoria等的報(bào)道相符[21]。此外,Ianiri等[22]推測(cè),棒曲霉素的生物降解由多個(gè)步驟組成,包括起始時(shí)菌體被激發(fā)起對(duì)棒曲霉素的耐受力。

圖6 S. cerevisiae對(duì)棒曲霉素的耐受力(NYDB培養(yǎng)基中)Fig.6 Tolerance of S. cerevisiaeto patulin in NYDB medium

2.3 S. cerevisiae KD和L. lactis MG1363 在蘋果汁中對(duì)棒曲霉素的降解及發(fā)酵作用

在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)置4個(gè)處理組,利用S.cerevisiaeKD和L.lactisMG1363對(duì)蘋果汁進(jìn)行混合發(fā)酵,2 d后對(duì)所有處理組中的棒曲霉素含量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)棒曲霉素均已被完全降解。

進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵液中的總可溶性固形物、酸度、黃酮含量、總酚含量進(jìn)行了檢測(cè)。由表2可知,處理組三中可溶性固形物發(fā)生了顯著下降(p<0.05),而其他處理組由于在發(fā)酵前添加了9%蔗糖,因而其可溶性固形物與純蘋果汁相比差異不大,甚至略有升高。同對(duì)照組相比,發(fā)酵后處理組一、二、三、四的酸度分別增加了1.3%、1.3%、1.2%、0.9%。酚類對(duì)果蔬的成熟衰老、抗病性、抗逆性均有重要影響,并有清除自由基、改善心血管疾病、抗發(fā)炎等活性[23]。4個(gè)處理組中總酚含量分別比對(duì)照上升了24%、37%、29%、42%。然而,發(fā)酵前后蘋果汁中黃酮的含量沒有發(fā)生顯著變化。目前,已知的微生物降解棒曲霉素的產(chǎn)物主要有ascladiol和desoxypatulinic acid[24],而S. cerevisiae降解棒曲霉素的產(chǎn)物為ascladiol[17]。據(jù)報(bào)道,棒曲霉素有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,而其降解產(chǎn)物ascladiol對(duì)人體的肝臟細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、小腸細(xì)胞等均無細(xì)胞毒性[25]。本文利用S.cerevisiaeKD和L.lactis對(duì)蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵,不僅控制了棒曲霉素的污染,去除了毒素的毒性,而且提高了蘋果汁中的總酚含量,增加附加值。通過添加一定的風(fēng)味物質(zhì)并進(jìn)行感官評(píng)定,可進(jìn)一步改善發(fā)酵果汁的口感,為菌株在被棒曲霉素污染的蘋果汁上的商業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

表2 發(fā)酵蘋果汁的品質(zhì)評(píng)估Table 2 Quality assessment of fermented apple juice

3 結(jié)論

棒曲霉素是自然界中主要的真菌毒素之一,尤其在水果、谷物及其制品中較為常見。本研究表明,S.cerevisiaeKD在NYDB培養(yǎng)基和市售100%蘋果汁中，均能高效控制棒曲霉素的污染,且酵母的起始濃度、棒曲霉素的起始濃度、環(huán)境pH等因素對(duì)酵母去除棒曲霉素的效率有一定程度的影響。S.cerevisiaeKD對(duì)棒曲霉素的耐受力較強(qiáng),在棒曲霉素濃度高達(dá)100 mg/L的環(huán)境下依然能較好生長。利用S.cerevisiaeKD和L.lactisMG1363對(duì)蘋果汁進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵,不僅能完全去除蘋果汁中棒曲霉素的污染,還能增強(qiáng)果汁的營養(yǎng)價(jià)值。因此,本文的研究結(jié)果為控制蘋果汁中棒曲霉素的污染、保證食品安全,提供新的途徑。